Avaliação imuno-histoquímica da expressão de Bcl-2 em diferentes tipos histológicos de carcinoma de
Endereço para correspondência :
Dr. Charu Suri, Endereço: Departamento de Patologia Oral e Maxilo-facial, Faculdade de Cirurgia Dentária Sri Sai, Distrito RR, Vikarabad - 01 Telefone: 9989233003, EmailId: charusuri87 & yahoo.com
Abstrato
O proto-oncogene bcl-2 foi descoberto em linfomas de células B e é o protótipo de genes reguladores da morte celular. Seu produto gênico, a proteína bcl-2, direta ou indiretamente, inibe a liberação do citocromo C, impedindo a ativação de caspases e, consequentemente, inibindo a apoptose. Isso leva à imortalização celular, contribuindo para a formação do tumor e facilitando a aquisição permanente de mutações.Estudos mostram aumento da expressão da proteína bcl-2 em cerca de 50% dos cânceres humanos. Tendo isso em vista, nosso estudo foi realizado para avaliar a expressão, quantificar e determinar a intensidade eo padrão de bcl-2 em vários graus histológicos de carcinoma de células escamosas.Método:O presente estudo investigou a expressão imuno-histoquímica de bcl-2 em 38 casos, dos quais 32 foram histologicamente diagnosticados como Carcinomas de Células Escamosas Orais e 5 linfonodos normais juntamente com 1 mucosa oral normal foram incluídos como controles.
Cada espécime foi seccionado com 3 microns de espessura, imunocorado com o anticorpo bcl-2 e visualizado sob um microscópio de luz.
Resultados:Todos os 38 casos apresentaram imunopositividade para bcl-2. O número de células positivas para bcl-2 foi maior no SCC pouco diferenciado do que no SCC bem diferenciado. A intensidade da expressão de bcl-2 foi mais moderadamente diferenciada no CEC, enquanto no CCD pouco diferenciado, um número igual de casos apresentou intensidade leve e escura. Quando o padrão de distribuição da expressão de bcl-2 foi avaliado, as ilhas tumorais desprovidas de queratinização central mostraram expressão de bcl-2 em todas as células tumorais.
Resumo e conclusão:Nos CCEs, o número de células expressando bcl-2 aumentou de bem diferenciado para pouco diferenciado, mostrando uma relação inversa com o grau de diferenciação. Outros estudos correlativos usando marcadores para outros membros da família bcl-2 são necessários para elucidar os defeitos moleculares específicos críticos para a biologia deste tumor, o que terá um impacto sobre o seu diagnóstico e tratamento.
Palavras-chave
Bcl-2, carcinoma de células escamosas (SCC), apoptose
Como citar este artigo:
SURI C. Avaliação imunohistoquímica da expressão de BCL-2 em diferentes graus histológicos de carcinoma de células escamas Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2009 dezembro [citado: 2018 29 de agosto]; 3: 1891-1899. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=December&volume=3&issue=6&page=1891-1899&id=601
IntroduçãoA prevalência de tumores da região da cabeça e pescoço está aumentando rapidamente e, em particular, o carcinoma de células escamosas (CEC) representa o tumor maligno mais frequente da cavidade oral. Há muito tempo, é evidente que o câncer tem uma etiologia multifatorial e é um processo de várias etapas que envolve iniciação, promoção e progressão do tumor.
A carcinogênese envolve a ativação de oncogenes e a inativação de genes supressores de tumor. As três principais vias antiproliferativas reconhecidas são: inibição do crescimento celular, indução da diferenciação celular e morte celular programada (apoptose).
Normalmente, a eliminação de células geneticamente danificadas por apoptose impede o desenvolvimento de tumores e também desempenha um papel na resposta eficaz à terapia do câncer, incluindo quimioterapia e radioterapia (1) . Ao contrário, o desequilíbrio da via apoptótica contribui para a imortalização. de células replicadoras, favorecendo assim o acúmulo de danos genéticos sequenciais que normalmente induziriam a morte celular (2) .
O proto-oncogene bcl-2 foi inicialmente descoberto em linfomas de células B que exibiram a aberração cromossômica t (14:18) q (32:31) e é o protótipo de genes reguladores da morte celular (3). Seu produto gênico, a proteína bcl-2, bloqueia um passo distal em uma via conservada evolutiva de apoptose. Sua expressão anormal, geralmente em termos de superexpressão em células geneticamente modificadas, como as células tumorais, contribui para a expansão do clone celular danificado, evitando a renovação celular devido à morte celular programada, levando à imortalização celular.
Objetivos e objetivos
Nosso estudo tem como objetivo explorar a imunorreatividade da proteína bcl-2 no carcinoma de células escamosas de boca na tentativa de elucidar sua influência no comportamento biológico dessa neoplasia.
Ao promover a sobrevivência celular, o bcl-2 facilita a aquisição permanente de mutações e transformação maligna (4)Além disso, o aumento da expressão de bcl-2 nas células cancerígenas possivelmente reflete a resistência das células tumorais à apoptose e pode ter implicações na sua capacidade de resposta aos tratamentos (5) .
Material e métodos
O material para o estudo incluiu 38 blocos de tecido embebidos em parafina fixados em formalina. Destes, 10, 12 e 10 bloqueios de cada carcinoma de células escamosas oral bem moderado e pouco diferenciado diagnosticados histologicamente, respectivamente, e 5 de linfonodos normais e 1 de mucosa normal como controles, foram considerados para coloração imuno-histoquímica para bcl-2.Os anticorpos e reagentes utilizados para a técnica imuno-histoquímica foram obtidos das empresas DAKO cytomation (DINAMARCA) e SIGMA ALDRICH (EUA).
Cortaram-se secções de 3 micron de espessura em micro lâminas revestidas com adesivo de poli-L-lisina e incubaram-se durante 1 hora a 48 graus centígrados. As seções foram então desparafinadas através de 3 trocas de xileno, hidratadas através de graus descendentes de álcool (100%, 90%, 70%) e levadas à água. As micro-secções foram então mergulhadas em 3% de H2O2 preparada recentemente em metanol por 20 minutos para bloquear a atividade da peroxidase endógena, seguida por uma lavagem em PBS
Para a recuperação antigênica, as micro-secções foram imersas em tampão de citrato de sódio pré-aquecido 0,01 milimolar e fervidas por 8 minutos em panela de pressão interna de aço inoxidável de 5 litros em um aquecedor elétrico. Isto aumenta a imunorreactividade do antigénio nos tecidos, permitindo que o antigénio bloqueado pela ligação cruzada do fixador de formalina seja descoberto quanto à ligação ao anticorpo relevante. As lâminas foram deixadas a arrefecer em tampão citrato, foram depois lavadas em água destilada durante 5 minutos e foram depois lavadas cuidadosamente em 3 substituições de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)
As seções foram então tratadas com soro de cabra a 10% em temperatura ambiente por 30 minutos para bloquear os locais de antígeno não específico, seguido de incubação com anticorpo primário (bcl-2) pré-diluído a 370C (1:50) por 60 minutos em um câmara úmida. Para controle de reagentes, nenhum anticorpo primário foi adicionado.
As secções foram então incubadas com anticorpo secundário biotinilado (anti-IgG de murganho de cabra conjugado com Fc) diluído a 1: 200, à temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de incubação com o conjugado de estreptavidina-peroxidase diluído a uma concentração de 1: 200. 30 minutos.
Para visualizao, as seces foram incubadas com diaminobenzidina tetra-hidrocloreto (DAB) a uma concentrao de 1:50 durante 5 minutos. As secções foram então ligeiramente contrastadas utilizando a hematoxilina de Meyer durante 95 segundos e foram depois lavadas suavemente em água corrente durante 2 minutos. As seções foram então desidratadas através de graus ascendentes de álcool, foram montadas com DPX e foram cobertas com lamínulas.
Avaliao A
avaliao das culas expressas por antigio foi realizada utilizando um microscio de luz com ampliaes de 10X e 40X.
Os critérios utilizados para definir as células positivas para o antigénio bcl-2 foram:
• coloração castanha em linfócitos (áreas positivas intrínsecas)
• coloração castanha no citoplasma e no núcleo das células tumorais.
Em cada caso, três campos foram selecionados aleatoriamente e 100 células foram contadas por campo com aumento de 40X. A intensidade da coloração foi classificada como clara / escura, comparando com o controlo positivo interno, que eram linfócitos. Nos diferentes graus de carcinoma de células escamosas, o padrão de coloração foi considerado como periferia quando a expressão foi vista apenas nas células periféricas das ilhas, enquanto foi classificada como inteira quando todas as células tumorais dentro das ilhas expressaram reatividade bcl-2 (Tabela / Fig 1) .
Análise Estatística
Os dados foram analisados utilizando o teste t para o nero de culas positivas para bcl-2 e utilizando o teste de tau-b de Kendall para a intensidade e localizao da colorao para eliminar o vi interobservador. Comparações dentro dos diferentes graus de CCEs foram submetidas ao teste de Fischer para o número de células positivas e ao teste de Qui Quadrado para intensidade e localização da coloração. Para a comparação intragrupo, aplicou-se Tukey HSD para o número de células positivas para bcl-2, teste exato de Fischer e teste Qui Quadrado para intensidade de coloração e o teste exato de Fischer foi aplicado para localização de coloração.
Resultados
Resultados e ObservaçãoNo presente estudo, as seções de controle dos linfonodos mostraram a expressão de bcl-2 nos linfócitos da zona do manto e a maioria dos linfócitos interfoliculares, enquanto apenas os linfócitos centrais germinais ocasionais expressaram bcl-2. Na mucosa oral normal, a expressão de bcl-2 foi observada em algumas células da camada basal. As camadas espinhosas suprabasais eram desprovidas da expressão do antigénio bcl-2.
Observou-se que todos os 32 casos de carcinoma espinocelular testados para a expressão de bcl-2 apresentaram imunopositividade. A coloração imuno-histoquímica das células tumorais mostrou citoplasma granular e a coloração do envelope nuclear foi positiva. Os locais de expressão (periferia / ilha inteira) nas ilhas / folhas tumorais foram anotados e a intensidade da expressão de bcl-2 também foi classificada como clara ou escura quando comparada com os linfócitos controle positivos internos. Para eliminar o viés subjetivo, dois observadores avaliaram independentemente a expressão de bcl-2 e para minimizar o viés interobservador, o teste t foi aplicado e o valor de p foi considerado não significativo. Assim, o número médio de células que expressam bcl-2 foi contado pelo observador 1 foi então submetido a análise estatística adicional.
Quando as células foram avaliadas para a expressão de bcl-2 em OSCCs bem, moderadamente e pouco diferenciados, o número médio de células foi encontrado para ser 187.600, 223.750 e 264.700, respectivamente. Aplicou-se o teste de Fischer nos resultados para comparar o número de células que expressam bcl-2 em diferentes graus de OSCCs e o valor p foi altamente significativo (p = 0,001) (Tabela / Fig. 2) .
Quando a expressão de bcl-2 foi comparada entre os diferentes graus de OSCCs, verificou-se que;
• Bem vs moderadamente diferenciado - diferença média de 36.150 células foi observada;
• Bem vs mal diferenciado - diferença média de 77.100 células foi observada;
• Moderadamente vs pouco diferenciado - foi
observadadiferença média de 40.950 células
Esses resultados de comparação comparativa, quando submetidos ao teste de Tukey HSD, mostraram valores de p que foram altamente significativos (p = 0,001) em todas as inter-comparações (Tabela / Figura 3) .
Após excluir o viés interobservador (Tabela / Fig. 4) para a intensidade de coloração das células positivas para bcl-2, observou-se que apenas 2 dos 10 casos dos OSCCs bem diferenciados mostraram uma intensidade de expressão escura em comparação com 10 de 12 casos do tipo moderadamente diferenciado e 5 em 10 dos casos pouco diferenciados, ou seja, de 32 amostras, 17 apresentaram coloração escura e 15 apresentaram coloração luminosa. Os resultados obtidos foram comparados com o teste “χ2” de Chi Square e o valor obtido foi 8.843, sendo o valor de p significativo (p = 0,012) (Tabela / Fig 5).
Ao comparar a intensidade da expressão entre graus individuais
• 2 dos 10 casos bem diferenciados apresentaram coloração escura em comparação com 10 dos 12 casos moderadamente diferenciados. O valor “χ2” foi encontrado em 8,824 e o valor p em 0,003, sendo a diferença altamente significativa (Tabela / Fig 6) (Tabela 6a).
• Da mesma forma, comparando casos bem diferenciados (2 de 10 casos) vs mal diferenciados (5 de 10 casos) utilizando o teste exato de Fischer, o valor de p obtido foi de 0,35, sendo a diferença não significativa (Tabela / Fig 6). ) (Quadro 6 b).
• Da mesma forma, ao comparar casos moderadamente diferenciados (10 de 12 casos) versus mal diferenciados (5 de 10 casos), o valor de p obtido pelo teste exato de Fischer foi de 0,172, o que não mostrou diferença significativa (Tabela / Fig. 6). ) (Quadro 6 c).
Quando comparada a localização das células positivas (periferia / ilha inteira) na ilha tumoral / folhas após viés interobservador foi descartada (Tabela / Fig 7), observou-se que 9 de 10 casos de CCEs bem diferenciados apresentaram coloração em ilhas tumorais inteiras, em comparação com 11 de 12 casos moderadamente diferenciados e 1 de 10 casos de CECOS pouco diferenciados. Os resultados obtidos foram comparados utilizando o teste qui quadrado “χ2”. O valor “χ2” obtido foi de 27,594, com valor p muito significativo (p = 0,001) (Tabela / Fig 8) .
Ao comparar a localização das células positivas entre os graus individuais, verificou-se que 9 dos 10 casos bem diferenciados apresentaram coloração em toda a ilha, em comparação com 11 dos 12 casos moderadamente diferenciados. O valor de p obtido com o teste exato de Fischer foi 1, sendo a diferença não significativa (tabela / figura 8) .
Observações também foram observadas para a expressão de bcl-2 no estroma do tecido conectivo e coloração positiva foi observada em algumas das células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos e ductos secretórios das glândulas salivares menores
Discussão
A morte celular programada ou apoptose é um passo crítico na diferenciação e turnover celular e na homeostase tecidual. Talvez as proteínas reguladoras melhor estudadas sejam a família de moléculas bcl-2. Avanços recentes na biologia do câncer mostraram que o processo de carcinogênese pode envolver não só aumento da proliferação celular, mas também diminuição da morte celular ou aumento da sobrevivência celular. Mutações de qualquer um dos genes que codificam proteínas anti-apoptóticas ou quaisquer alterações nos níveis de sua expressão podem levar ao aumento da sobrevivência celular.Neste estudo imuno-histoquímico, a expressão de Bcl-2 foi observada em 32 casos de carcinoma de células escamosas, o que também foi visto por Ravi et al (1999) em seu estudo sobre carcinoma de células escamosas (6). A expressão de bcl-2 estava na forma de coloração citoplasmática granular com uma acentuação em torno da membrana nuclear. Isto é devido à localização celular de bcl-2 na membrana externa da mitocôndria, no retículo endoplasmático e na membrana nuclear.
Neste estudo, o número de células positivas para bcl-2 foi maior no carcinoma de células escamosas pouco diferenciado (média de 264.700) do que no carcinoma de células escamosas bem diferenciado (média 187.600). Um aumento da expressão de bcl-2 em carcinoma de células escamosas pouco diferenciado também foi visto por Yu chen et al (2000) e Muzio et al (2003) (7) , (8). Esta observação de um aumento no número de células positivas para bcl-2 com uma diminuição na diferenciação, provavelmente reflete que bcl-2 é expresso em queratinócitos que têm uma capacidade aumentada de sobrevivência.
No entanto, em estudos anteriores de Loro et al (1999), a expressão da oncoproteína bcl-2 foi suprimida em carcinoma de células escamosas pouco diferenciado. Esta variao no padr de express que foi detectel pelo anticorpo bcl-2, pode ser devido activao de caspases electivas, resultando na degradao proteolica de bcl-2 em culas tumorais (9) .
Estudos realizados em carcinoma de células escamosas do esôfago e cavidade oral por Jordan et al (1996), mostraram uma maior porcentagem de imunorreatividade em carcinomas pouco diferenciados do que em carcinomas bem diferenciados (10).. No entanto, essa imunorreatividade uniforme não foi observada nos carcinomas pulmonares nos estudos de Francesso Pezella et al (1993) (11) . Esta variação sugere que a expressão de bcl-2 pode ser específica de órgão e pode depender do comportamento biológico de tumores individuais.
A actividade da famia bcl-2 parcialmente regulada pela formao de homo e heteroderos e a concentrao relativa dos membros prapopticos e antiapopticos que decidiriam o resultado de uma cula desafiada por um estulo apoptico. Neste estudo, a intensidade da expressão de bcl-2 foi escura em menos casos de carcinomas bem diferenciados (2 casos) em comparação com carcinomas de células escamosas moderadamente diferenciados (9 casos). Em CCS pouco diferenciado, um número igual de casos (5 cada) apresentou intensidades claras e escuras. O aumento do número de casos mostrando uma intensidade escura de expressão em carcinomas moderadamente diferenciados poderia ser devido ao aumento da atividade da proteína bcl-2 durante os estágios iniciais da progressão do tumor. No entanto, como há uma interação funcional entre os diferentes membros do bcl-2 e também,
A diferenciação terminal é uma forma de morte celular programada que ocorre no epitélio oral, onde as células basais proliferam, amadurecem e se diferenciam para formar escamas de queratina. Quando o padrão de distribuição da expressão de bcl-2 foi avaliado, observou-se que as ilhas tumorais que eram desprovidas de queratinização central apresentaram expressão de bcl-2 em todas as células tumorais. No entanto, aquelas ilhas que possuíam células neoplásicas queratinizadas apresentaram imunorreatividade diminuída ou ausente no centro com coloração restrita apenas às células periféricas. Estas observações são semelhantes às de Teni et al (2002) (12) . No entanto, Loro et al (1999) observaram que as ilhas tumorais desprovidas de qualquer queratina nas partes centrais das ilhas mostraram uma perda progressiva da imunorreatividade do bcl-2. (13). o que sugere que as células centrais são diferenciadas e, além disso, têm o potencial de se diferenciarem terminalmente. Em tumores pouco diferenciados, a imunorreatividade para bcl-2 foi observada em toda a população de células tumorais. Esta superexpressão possivelmente reflete a resistência dessas células tumorais à apoptose e aumento da sobrevivência celular.
A imunorreatividade da Bcl-2 na mucosa oral normal está confinada à camada basal e possivelmente está envolvida na preservação de um reservatório adequado de células-tronco proliferativas, enquanto as outras proteínas apoptóticas, como a bax, predominam nas camadas superficiais.13Em todos os casos examinados para o epitélio displásico suprajacente, a expressão de bcl-2 foi observada mesmo nas camadas superficiais, sugerindo uma alteração na expressão normal de bcl-2. O epitélio não neoplásico adjacente aos CCEs, observado em alguns casos, mostrou expressão de bcl-2 em algumas células basais, como também foi observado no epitélio normal que foi tomado como controle.
A regulação positiva da proteína Bcl-2 em células endoteliais microvasculares tumorais pode ser induzida pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) que aumenta a disponibilidade de oxigênio e nutrientes para as células tumorais. A expressão de Bcl-2 também foi observada nas células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos. Nem JE et al (2001) observaram a expressão de bcl-2 em células endoteliais e sugeriram que essas células que superexpressam bcl-2 secretam quantidades aumentadas de quimiocina IL-8 que funciona como um indutor endógeno de angiogênese tumoral (14) .
A expressão de Bcl-2 também foi observada em algumas células do ducto das glândulas salivares menores, o que é consistente com os achados de Qi Long et al (1993) que examinaram a expressão de bcl-2 em tecidos embrionários não hematopoéticos, em que bcl-2 expressão foi observada em todas as células do ducto de todas as glândulas exócrinas, incluindo glândulas salivares, pancreáticas e sudoríparas. A expressão vista em poucas células do ducto sugere que essas células são células de reserva indiferenciadas (15) .
Os achados do nosso estudo mostram que a inibição da apoptose é um evento freqüente em carcinomas de células escamosas. A família de proteínas bcl-2 parece estar envolvida na regulação da diferenciação terminal dos queratinócitos. A regulação negativa da expressão de bcl-2 foi concomitante com a diferenciação terminal e um aumento da expressão sobre esta proteína protege as células tumorais de sofrerem apoptose, facilitando assim a sua sobrevivência.
No entanto, estudos adicionais utilizando um tamanho de amostra maior e avaliando a família de proteínas bcl-2 podem fornecer informações úteis para uma classificação mais precisa do tumor com base em uma base biológica.
Conclusão
Resumo e conclusãoNos CCEs, o número de células que expressam bcl-2 aumentou de bem diferenciado para pouco diferenciado, mostrando uma relação inversa com o grau de diferenciação do tumor. Como a onco-proteína bcl-2 regula a morte celular programada, permitindo que as células tumorais escapem da apoptose, promove a sua sobrevivência, facilitando assim a aquisição de mais mutações.
Outros estudos correlativos usando marcadores para outros membros da família bcl-2 são necessários para elucidar os defeitos moleculares específicos críticos para a biologia deste tumor, o que terá um impacto no diagnóstico e tratamento.
Referências
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Dr. Charu Suri, Endereço: Departamento de Patologia Oral e Maxilo-facial, Faculdade de Cirurgia Dentária Sri Sai, Distrito RR, Vikarabad - 01 Telefone: 9989233003, EmailId: charusuri87 & yahoo.com
Abstrato
O proto-oncogene bcl-2 foi descoberto em linfomas de células B e é o protótipo de genes reguladores da morte celular. Seu produto gênico, a proteína bcl-2, direta ou indiretamente, inibe a liberação do citocromo C, impedindo a ativação de caspases e, consequentemente, inibindo a apoptose. Isso leva à imortalização celular, contribuindo para a formação do tumor e facilitando a aquisição permanente de mutações.Estudos mostram aumento da expressão da proteína bcl-2 em cerca de 50% dos cânceres humanos. Tendo isso em vista, nosso estudo foi realizado para avaliar a expressão, quantificar e determinar a intensidade eo padrão de bcl-2 em vários graus histológicos de carcinoma de células escamosas.Método:O presente estudo investigou a expressão imuno-histoquímica de bcl-2 em 38 casos, dos quais 32 foram histologicamente diagnosticados como Carcinomas de Células Escamosas Orais e 5 linfonodos normais juntamente com 1 mucosa oral normal foram incluídos como controles.Cada espécime foi seccionado com 3 microns de espessura, imunocorado com o anticorpo bcl-2 e visualizado sob um microscópio de luz.
Resultados:Todos os 38 casos apresentaram imunopositividade para bcl-2. O número de células positivas para bcl-2 foi maior no SCC pouco diferenciado do que no SCC bem diferenciado. A intensidade da expressão de bcl-2 foi mais moderadamente diferenciada no CEC, enquanto no CCD pouco diferenciado, um número igual de casos apresentou intensidade leve e escura. Quando o padrão de distribuição da expressão de bcl-2 foi avaliado, as ilhas tumorais desprovidas de queratinização central mostraram expressão de bcl-2 em todas as células tumorais.
Resumo e conclusão:Nos CCEs, o número de células expressando bcl-2 aumentou de bem diferenciado para pouco diferenciado, mostrando uma relação inversa com o grau de diferenciação. Outros estudos correlativos usando marcadores para outros membros da família bcl-2 são necessários para elucidar os defeitos moleculares específicos críticos para a biologia deste tumor, o que terá um impacto sobre o seu diagnóstico e tratamento.
Palavras-chave
Bcl-2, carcinoma de células escamosas (SCC), apoptose
Como citar este artigo:
SURI C. Avaliação imunohistoquímica da expressão de BCL-2 em diferentes graus histológicos de carcinoma de células escamas Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2009 dezembro [citado: 2018 29 de agosto]; 3: 1891-1899. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=December&volume=3&issue=6&page=1891-1899&id=601
IntroduçãoA prevalência de tumores da região da cabeça e pescoço está aumentando rapidamente e, em particular, o carcinoma de células escamosas (CEC) representa o tumor maligno mais frequente da cavidade oral. Há muito tempo, é evidente que o câncer tem uma etiologia multifatorial e é um processo de várias etapas que envolve iniciação, promoção e progressão do tumor.A carcinogênese envolve a ativação de oncogenes e a inativação de genes supressores de tumor. As três principais vias antiproliferativas reconhecidas são: inibição do crescimento celular, indução da diferenciação celular e morte celular programada (apoptose).
Normalmente, a eliminação de células geneticamente danificadas por apoptose impede o desenvolvimento de tumores e também desempenha um papel na resposta eficaz à terapia do câncer, incluindo quimioterapia e radioterapia (1) . Ao contrário, o desequilíbrio da via apoptótica contribui para a imortalização. de células replicadoras, favorecendo assim o acúmulo de danos genéticos sequenciais que normalmente induziriam a morte celular (2) .
O proto-oncogene bcl-2 foi inicialmente descoberto em linfomas de células B que exibiram a aberração cromossômica t (14:18) q (32:31) e é o protótipo de genes reguladores da morte celular (3). Seu produto gênico, a proteína bcl-2, bloqueia um passo distal em uma via conservada evolutiva de apoptose. Sua expressão anormal, geralmente em termos de superexpressão em células geneticamente modificadas, como as células tumorais, contribui para a expansão do clone celular danificado, evitando a renovação celular devido à morte celular programada, levando à imortalização celular.
Objetivos e objetivos
Nosso estudo tem como objetivo explorar a imunorreatividade da proteína bcl-2 no carcinoma de células escamosas de boca na tentativa de elucidar sua influência no comportamento biológico dessa neoplasia.
Ao promover a sobrevivência celular, o bcl-2 facilita a aquisição permanente de mutações e transformação maligna (4)Além disso, o aumento da expressão de bcl-2 nas células cancerígenas possivelmente reflete a resistência das células tumorais à apoptose e pode ter implicações na sua capacidade de resposta aos tratamentos (5) .
Material e métodos
O material para o estudo incluiu 38 blocos de tecido embebidos em parafina fixados em formalina. Destes, 10, 12 e 10 bloqueios de cada carcinoma de células escamosas oral bem moderado e pouco diferenciado diagnosticados histologicamente, respectivamente, e 5 de linfonodos normais e 1 de mucosa normal como controles, foram considerados para coloração imuno-histoquímica para bcl-2.Os anticorpos e reagentes utilizados para a técnica imuno-histoquímica foram obtidos das empresas DAKO cytomation (DINAMARCA) e SIGMA ALDRICH (EUA).Cortaram-se secções de 3 micron de espessura em micro lâminas revestidas com adesivo de poli-L-lisina e incubaram-se durante 1 hora a 48 graus centígrados. As seções foram então desparafinadas através de 3 trocas de xileno, hidratadas através de graus descendentes de álcool (100%, 90%, 70%) e levadas à água. As micro-secções foram então mergulhadas em 3% de H2O2 preparada recentemente em metanol por 20 minutos para bloquear a atividade da peroxidase endógena, seguida por uma lavagem em PBS
Para a recuperação antigênica, as micro-secções foram imersas em tampão de citrato de sódio pré-aquecido 0,01 milimolar e fervidas por 8 minutos em panela de pressão interna de aço inoxidável de 5 litros em um aquecedor elétrico. Isto aumenta a imunorreactividade do antigénio nos tecidos, permitindo que o antigénio bloqueado pela ligação cruzada do fixador de formalina seja descoberto quanto à ligação ao anticorpo relevante. As lâminas foram deixadas a arrefecer em tampão citrato, foram depois lavadas em água destilada durante 5 minutos e foram depois lavadas cuidadosamente em 3 substituições de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)
As seções foram então tratadas com soro de cabra a 10% em temperatura ambiente por 30 minutos para bloquear os locais de antígeno não específico, seguido de incubação com anticorpo primário (bcl-2) pré-diluído a 370C (1:50) por 60 minutos em um câmara úmida. Para controle de reagentes, nenhum anticorpo primário foi adicionado.
As secções foram então incubadas com anticorpo secundário biotinilado (anti-IgG de murganho de cabra conjugado com Fc) diluído a 1: 200, à temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de incubação com o conjugado de estreptavidina-peroxidase diluído a uma concentração de 1: 200. 30 minutos.
Para visualizao, as seces foram incubadas com diaminobenzidina tetra-hidrocloreto (DAB) a uma concentrao de 1:50 durante 5 minutos. As secções foram então ligeiramente contrastadas utilizando a hematoxilina de Meyer durante 95 segundos e foram depois lavadas suavemente em água corrente durante 2 minutos. As seções foram então desidratadas através de graus ascendentes de álcool, foram montadas com DPX e foram cobertas com lamínulas.
Avaliao A
avaliao das culas expressas por antigio foi realizada utilizando um microscio de luz com ampliaes de 10X e 40X.
Os critérios utilizados para definir as células positivas para o antigénio bcl-2 foram:
• coloração castanha em linfócitos (áreas positivas intrínsecas)
• coloração castanha no citoplasma e no núcleo das células tumorais.
Em cada caso, três campos foram selecionados aleatoriamente e 100 células foram contadas por campo com aumento de 40X. A intensidade da coloração foi classificada como clara / escura, comparando com o controlo positivo interno, que eram linfócitos. Nos diferentes graus de carcinoma de células escamosas, o padrão de coloração foi considerado como periferia quando a expressão foi vista apenas nas células periféricas das ilhas, enquanto foi classificada como inteira quando todas as células tumorais dentro das ilhas expressaram reatividade bcl-2 (Tabela / Fig 1) .
Análise Estatística
Os dados foram analisados utilizando o teste t para o nero de culas positivas para bcl-2 e utilizando o teste de tau-b de Kendall para a intensidade e localizao da colorao para eliminar o vi interobservador. Comparações dentro dos diferentes graus de CCEs foram submetidas ao teste de Fischer para o número de células positivas e ao teste de Qui Quadrado para intensidade e localização da coloração. Para a comparação intragrupo, aplicou-se Tukey HSD para o número de células positivas para bcl-2, teste exato de Fischer e teste Qui Quadrado para intensidade de coloração e o teste exato de Fischer foi aplicado para localização de coloração.
Resultados
Resultados e ObservaçãoNo presente estudo, as seções de controle dos linfonodos mostraram a expressão de bcl-2 nos linfócitos da zona do manto e a maioria dos linfócitos interfoliculares, enquanto apenas os linfócitos centrais germinais ocasionais expressaram bcl-2. Na mucosa oral normal, a expressão de bcl-2 foi observada em algumas células da camada basal. As camadas espinhosas suprabasais eram desprovidas da expressão do antigénio bcl-2.Observou-se que todos os 32 casos de carcinoma espinocelular testados para a expressão de bcl-2 apresentaram imunopositividade. A coloração imuno-histoquímica das células tumorais mostrou citoplasma granular e a coloração do envelope nuclear foi positiva. Os locais de expressão (periferia / ilha inteira) nas ilhas / folhas tumorais foram anotados e a intensidade da expressão de bcl-2 também foi classificada como clara ou escura quando comparada com os linfócitos controle positivos internos. Para eliminar o viés subjetivo, dois observadores avaliaram independentemente a expressão de bcl-2 e para minimizar o viés interobservador, o teste t foi aplicado e o valor de p foi considerado não significativo. Assim, o número médio de células que expressam bcl-2 foi contado pelo observador 1 foi então submetido a análise estatística adicional.
Quando as células foram avaliadas para a expressão de bcl-2 em OSCCs bem, moderadamente e pouco diferenciados, o número médio de células foi encontrado para ser 187.600, 223.750 e 264.700, respectivamente. Aplicou-se o teste de Fischer nos resultados para comparar o número de células que expressam bcl-2 em diferentes graus de OSCCs e o valor p foi altamente significativo (p = 0,001) (Tabela / Fig. 2) .
Quando a expressão de bcl-2 foi comparada entre os diferentes graus de OSCCs, verificou-se que;
• Bem vs moderadamente diferenciado - diferença média de 36.150 células foi observada;
• Bem vs mal diferenciado - diferença média de 77.100 células foi observada;
• Moderadamente vs pouco diferenciado - foi
observadadiferença média de 40.950 células
Esses resultados de comparação comparativa, quando submetidos ao teste de Tukey HSD, mostraram valores de p que foram altamente significativos (p = 0,001) em todas as inter-comparações (Tabela / Figura 3) .
Após excluir o viés interobservador (Tabela / Fig. 4) para a intensidade de coloração das células positivas para bcl-2, observou-se que apenas 2 dos 10 casos dos OSCCs bem diferenciados mostraram uma intensidade de expressão escura em comparação com 10 de 12 casos do tipo moderadamente diferenciado e 5 em 10 dos casos pouco diferenciados, ou seja, de 32 amostras, 17 apresentaram coloração escura e 15 apresentaram coloração luminosa. Os resultados obtidos foram comparados com o teste “χ2” de Chi Square e o valor obtido foi 8.843, sendo o valor de p significativo (p = 0,012) (Tabela / Fig 5).
Ao comparar a intensidade da expressão entre graus individuais
• 2 dos 10 casos bem diferenciados apresentaram coloração escura em comparação com 10 dos 12 casos moderadamente diferenciados. O valor “χ2” foi encontrado em 8,824 e o valor p em 0,003, sendo a diferença altamente significativa (Tabela / Fig 6) (Tabela 6a).
• Da mesma forma, comparando casos bem diferenciados (2 de 10 casos) vs mal diferenciados (5 de 10 casos) utilizando o teste exato de Fischer, o valor de p obtido foi de 0,35, sendo a diferença não significativa (Tabela / Fig 6). ) (Quadro 6 b).
• Da mesma forma, ao comparar casos moderadamente diferenciados (10 de 12 casos) versus mal diferenciados (5 de 10 casos), o valor de p obtido pelo teste exato de Fischer foi de 0,172, o que não mostrou diferença significativa (Tabela / Fig. 6). ) (Quadro 6 c).
Quando comparada a localização das células positivas (periferia / ilha inteira) na ilha tumoral / folhas após viés interobservador foi descartada (Tabela / Fig 7), observou-se que 9 de 10 casos de CCEs bem diferenciados apresentaram coloração em ilhas tumorais inteiras, em comparação com 11 de 12 casos moderadamente diferenciados e 1 de 10 casos de CECOS pouco diferenciados. Os resultados obtidos foram comparados utilizando o teste qui quadrado “χ2”. O valor “χ2” obtido foi de 27,594, com valor p muito significativo (p = 0,001) (Tabela / Fig 8) .
Ao comparar a localização das células positivas entre os graus individuais, verificou-se que 9 dos 10 casos bem diferenciados apresentaram coloração em toda a ilha, em comparação com 11 dos 12 casos moderadamente diferenciados. O valor de p obtido com o teste exato de Fischer foi 1, sendo a diferença não significativa (tabela / figura 8) .
Observações também foram observadas para a expressão de bcl-2 no estroma do tecido conectivo e coloração positiva foi observada em algumas das células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos e ductos secretórios das glândulas salivares menores
Discussão
A morte celular programada ou apoptose é um passo crítico na diferenciação e turnover celular e na homeostase tecidual. Talvez as proteínas reguladoras melhor estudadas sejam a família de moléculas bcl-2. Avanços recentes na biologia do câncer mostraram que o processo de carcinogênese pode envolver não só aumento da proliferação celular, mas também diminuição da morte celular ou aumento da sobrevivência celular. Mutações de qualquer um dos genes que codificam proteínas anti-apoptóticas ou quaisquer alterações nos níveis de sua expressão podem levar ao aumento da sobrevivência celular.Neste estudo imuno-histoquímico, a expressão de Bcl-2 foi observada em 32 casos de carcinoma de células escamosas, o que também foi visto por Ravi et al (1999) em seu estudo sobre carcinoma de células escamosas (6). A expressão de bcl-2 estava na forma de coloração citoplasmática granular com uma acentuação em torno da membrana nuclear. Isto é devido à localização celular de bcl-2 na membrana externa da mitocôndria, no retículo endoplasmático e na membrana nuclear.Neste estudo, o número de células positivas para bcl-2 foi maior no carcinoma de células escamosas pouco diferenciado (média de 264.700) do que no carcinoma de células escamosas bem diferenciado (média 187.600). Um aumento da expressão de bcl-2 em carcinoma de células escamosas pouco diferenciado também foi visto por Yu chen et al (2000) e Muzio et al (2003) (7) , (8). Esta observação de um aumento no número de células positivas para bcl-2 com uma diminuição na diferenciação, provavelmente reflete que bcl-2 é expresso em queratinócitos que têm uma capacidade aumentada de sobrevivência.
No entanto, em estudos anteriores de Loro et al (1999), a expressão da oncoproteína bcl-2 foi suprimida em carcinoma de células escamosas pouco diferenciado. Esta variao no padr de express que foi detectel pelo anticorpo bcl-2, pode ser devido activao de caspases electivas, resultando na degradao proteolica de bcl-2 em culas tumorais (9) .
Estudos realizados em carcinoma de células escamosas do esôfago e cavidade oral por Jordan et al (1996), mostraram uma maior porcentagem de imunorreatividade em carcinomas pouco diferenciados do que em carcinomas bem diferenciados (10).. No entanto, essa imunorreatividade uniforme não foi observada nos carcinomas pulmonares nos estudos de Francesso Pezella et al (1993) (11) . Esta variação sugere que a expressão de bcl-2 pode ser específica de órgão e pode depender do comportamento biológico de tumores individuais.
A actividade da famia bcl-2 parcialmente regulada pela formao de homo e heteroderos e a concentrao relativa dos membros prapopticos e antiapopticos que decidiriam o resultado de uma cula desafiada por um estulo apoptico. Neste estudo, a intensidade da expressão de bcl-2 foi escura em menos casos de carcinomas bem diferenciados (2 casos) em comparação com carcinomas de células escamosas moderadamente diferenciados (9 casos). Em CCS pouco diferenciado, um número igual de casos (5 cada) apresentou intensidades claras e escuras. O aumento do número de casos mostrando uma intensidade escura de expressão em carcinomas moderadamente diferenciados poderia ser devido ao aumento da atividade da proteína bcl-2 durante os estágios iniciais da progressão do tumor. No entanto, como há uma interação funcional entre os diferentes membros do bcl-2 e também,
A diferenciação terminal é uma forma de morte celular programada que ocorre no epitélio oral, onde as células basais proliferam, amadurecem e se diferenciam para formar escamas de queratina. Quando o padrão de distribuição da expressão de bcl-2 foi avaliado, observou-se que as ilhas tumorais que eram desprovidas de queratinização central apresentaram expressão de bcl-2 em todas as células tumorais. No entanto, aquelas ilhas que possuíam células neoplásicas queratinizadas apresentaram imunorreatividade diminuída ou ausente no centro com coloração restrita apenas às células periféricas. Estas observações são semelhantes às de Teni et al (2002) (12) . No entanto, Loro et al (1999) observaram que as ilhas tumorais desprovidas de qualquer queratina nas partes centrais das ilhas mostraram uma perda progressiva da imunorreatividade do bcl-2. (13). o que sugere que as células centrais são diferenciadas e, além disso, têm o potencial de se diferenciarem terminalmente. Em tumores pouco diferenciados, a imunorreatividade para bcl-2 foi observada em toda a população de células tumorais. Esta superexpressão possivelmente reflete a resistência dessas células tumorais à apoptose e aumento da sobrevivência celular.
A imunorreatividade da Bcl-2 na mucosa oral normal está confinada à camada basal e possivelmente está envolvida na preservação de um reservatório adequado de células-tronco proliferativas, enquanto as outras proteínas apoptóticas, como a bax, predominam nas camadas superficiais.13Em todos os casos examinados para o epitélio displásico suprajacente, a expressão de bcl-2 foi observada mesmo nas camadas superficiais, sugerindo uma alteração na expressão normal de bcl-2. O epitélio não neoplásico adjacente aos CCEs, observado em alguns casos, mostrou expressão de bcl-2 em algumas células basais, como também foi observado no epitélio normal que foi tomado como controle.
A regulação positiva da proteína Bcl-2 em células endoteliais microvasculares tumorais pode ser induzida pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) que aumenta a disponibilidade de oxigênio e nutrientes para as células tumorais. A expressão de Bcl-2 também foi observada nas células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos. Nem JE et al (2001) observaram a expressão de bcl-2 em células endoteliais e sugeriram que essas células que superexpressam bcl-2 secretam quantidades aumentadas de quimiocina IL-8 que funciona como um indutor endógeno de angiogênese tumoral (14) .
A expressão de Bcl-2 também foi observada em algumas células do ducto das glândulas salivares menores, o que é consistente com os achados de Qi Long et al (1993) que examinaram a expressão de bcl-2 em tecidos embrionários não hematopoéticos, em que bcl-2 expressão foi observada em todas as células do ducto de todas as glândulas exócrinas, incluindo glândulas salivares, pancreáticas e sudoríparas. A expressão vista em poucas células do ducto sugere que essas células são células de reserva indiferenciadas (15) .
Os achados do nosso estudo mostram que a inibição da apoptose é um evento freqüente em carcinomas de células escamosas. A família de proteínas bcl-2 parece estar envolvida na regulação da diferenciação terminal dos queratinócitos. A regulação negativa da expressão de bcl-2 foi concomitante com a diferenciação terminal e um aumento da expressão sobre esta proteína protege as células tumorais de sofrerem apoptose, facilitando assim a sua sobrevivência.
No entanto, estudos adicionais utilizando um tamanho de amostra maior e avaliando a família de proteínas bcl-2 podem fornecer informações úteis para uma classificação mais precisa do tumor com base em uma base biológica.
Conclusão
Resumo e conclusãoNos CCEs, o número de células que expressam bcl-2 aumentou de bem diferenciado para pouco diferenciado, mostrando uma relação inversa com o grau de diferenciação do tumor. Como a onco-proteína bcl-2 regula a morte celular programada, permitindo que as células tumorais escapem da apoptose, promove a sua sobrevivência, facilitando assim a aquisição de mais mutações.Outros estudos correlativos usando marcadores para outros membros da família bcl-2 são necessários para elucidar os defeitos moleculares específicos críticos para a biologia deste tumor, o que terá um impacto no diagnóstico e tratamento.
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