Induzível AmpC Beta-Lactamase Produzindo Pseudomonas Aeruginosa Isolado Em Um Hospital Rural Da Índi
(MD) Professor de Microbiologia, ** Assistente de Pesquisa, Depto de, Microbiologia, *** (MD) Professor de Microbiologia, *** (MBBS) Tutor, Dept. de Faculdade de Medicina Microbiologia Jawaharlal Nehru, Wardha (MS)
Endereço para correspondência :
Dr. S. Basak
Professor de Microbiologia
da Faculdade de Medicina J.
Sawangi (M), Wardha-442004 (MS)
E-mail: drsbasak1@yahoo.com.
Abstrato
Pseudomonas aeruginosa, um dos patógenos mais comuns que causam infecções nosocomiais, apresenta resistência crescente a antibióticos β-lactâmicos, especialmente pela produção de β-lactamases AmpC. Assim, este estudo foi realizado para determinar a prevalência de β-lactamases AmpC indutíveis produzindo Pseudomonas aeruginosa em nosso hospital e seu padrão de suscetibilidade a antibióticos antipseudomonal mais novos.Foram estudados 244 isolados de Pseudomonas aeruginosa. Os isolados que mostram o embotamento da zona de inibição da ceftazidima adjacente ao disco de cefoxitina foram considerados positivos na tela e foram selecionados para confirmação de β-lactamases AmpC indutíveis produzidas por teste tridimensional modificado e teste de disco AmpC. O padrão de suscetibilidade in vitro de antibióticos antipseudomonais foi feito pelo método de difusão em disco de Kirby Bauer.Dos 244 isolados de Pseudomonas aeruginosa, 47 (19,3%) foram positivos no teste, que foram confirmados pelo teste tridimensional modificado e pelo teste de disco AmpC. O padrão de sensibilidade mais elevado observado foi Imipenem, Amicacina e Ciprofloxacina.
Concluímos que, para evitar o uso indevido de antibióticos e iniciar antibióticos adequados para pacientes hospitalizados, os testes para as β-lactamases AmpC devem ser feitos em laboratórios de Microbiologia Clínica.
Palavras-chave
Pseudomonas aeruginosa,? -Lactamase de AmpC indutel, teste de disco AmpC.
Como citar este artigo:
BASAK S, KHODKE M, BOSE S, MALLICK SK. INDUZIDA AMPC BETA-LACTAMASE PRODUZINDO PSEUDOMONAS AERUGINOSA ISOLADA EM UM HOSPITAL RURAL DA ÍNDIA CENTRAL. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2009 dezembro [citado: 2018 29 de agosto]; 3: 1921-1927. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=December&volume=3&issue=6&page=1921-1927&id=599
Introdução APseudomonas aeruginosa é um dos patógenos mais comuns que causam infecção nosocomial. É intrinsecamente resistente a muitos antibióticos, incluindo novos antibióticos β-lactâmicos, ou pode desenvolver resistência durante o tratamento, levando a alta mortalidade e morbidade.
O mecanismo mais comum de resistência a antibióticos β-lactâmicos em bactérias Gram negativas é predominantemente devido à produção de β-lactamases que clivam o anel β-lactâmico estrutural. De acordo com a classificação da estrutura molecular de Ambler 1980, as principais classes de β-lactamases são A, C, D (1) .
Pseudomonas aeruginosa pode produzir todas as principais classes de β-lactamases (A, C, D) e também metalobetalactamases, ou seja, classe B. A exposição persistente de Pseudomonas aeruginosa a antibióticos β-lactâmicos leva à mutação e superprodução de AmpC ou β-lactamases de classe C. Estas são cefalosporinases que foram classificadas por Ambler em 1980 (1) como classe molecular C e de acordo com Bush et al (2) foram classificadas como Grupo I. As β-lactamases de AmpC conferem resistência a oximino- falfalosporinas, 7α metoxi-cefalosporinas (cefoxitina e cefotetan).
As β-lactamases AmpC que são mediadas cromossomicamente foram descritas em Acinetobacter sp, Morganella morganii, Citrobacter freundii, Enterobacter sp, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Serratia marcescens, E.coli, Hafnia alvei, etc. Na maioria destas bactérias AmpC é indutível via um sistema envolvendo ampD, ampG, ampR e intermediários na reciclagem de peptidoglicano (3) , (4) . O gene ampC de E. coli é normalmente expresso em um nível baixo, mas não induzido porque o ampR está ausente (5) .
As β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos surgiram através da transferência de genes cromossómicos de β-lactamases AmpC para plasmídeos (6).. As β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos foram encontradas em Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp, Proteus mirabilis e mesmo E. coli e foram relatadas pela primeira vez em 1988 (7) .
Actualmente, todas as β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos têm um perfil de substrato semelhante às β-lactamases AmpC cromossómicas. Mas a única diferença é que as β-lactamases AmpC cromossómicas são indutíveis quando as β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos não são indutíveis (8) .
As β-lactamases AmpC conferem resistência às cefalosporinas no grupo oxiiminm (ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona, ceftizoxima, cefuroxima) e no grupo 7-α-metoxi (cefoxitina, cefotetan, cefmetazole, moxalactam) e monobactum (azotrenam) e não são afetadas pela disponibilidade Inibidores da β-lactamase, ou seja, ácido clavulânico, sulbactum, etc.
Os organismos produtores de β-lactamases AmpC estão em ascensão e levam ao insucesso terapêutico se as cefalosporinas de 3ª Geração forem fornecidas empiricamente ou não testadas no laboratório para produção de β-lactamases AmpC. Especialmente, as β-lactamases de AmpC indutíveis podem ser induzidas a várias centenas de vezes mais altas na presença de ácido clavulânico, onde o ácido clavulânico é comumente usado como inibidor de β-lactamases de espectro ampliado (ESBL) (9) .
Objetivos e objetivos
O presente estudo foi realizado:
1. Determinar a prevalência de Pseudomonas aeruginosa produtora de β-lactamase AmpC induzível isolada em um hospital rural na Índia Central.
2. Detectar o padrão de suscetibilidade antibiótica das cepas de Pseudomonas aeruginosa a antibióticos antipseudomânicos mais novos.
Material e métodos
O estudo foi realizado por um período de um ano, de 1 de setembro de 2006 a 31 de agosto de 2007. Um total de 244 cepas de Pseudomonas aeruginosa foi isolado de diferentes amostras clínicas, por exemplo, urina, pus, escarro, sangue, secreções do tubo endotraqueal e outras em laboratório de Microbiologia. da Faculdade de Medicina Jawaharlal Nehru, Wardha (MS) e foram identificados de acordo com os métodos convencionais (10). Outros espécimes incluem swab da garganta, descarga da orelha, pontas do cateter, líquido peritoneal, swab vaginal, swab da mucosa bucal etc. Padrão de suscetibilidade antibiótica de isolados de Pseudomonas aeruginosa a antibióticos antipseudomânicos mais novos, por exemplo Meropenem (10µg), Imipenem (10µg), Amicacina (30µg) , ciprofloxacina (5), Pipercilina / Tazobacta (100/10), Azotrenam (30), Cefepima (30), Ceftazidima (30), Netilmicina (30), foram detectados pelo modo de difus em disco de Kirby-Bauer (11) . Os discos de antibiicos foram adquiridos a HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Índia. O rastreio da β-lactamase AmpC foi feito pelo teste de antagonismo de disco (12) . A confirmação da produção de β-lactamase AmpC foi feita por teste tridimensional modificado (MTDT) (13) e teste de disco AmpC (14) .Teste de Antiagonismo de Disco
Neste teste, a cultura de gramado do isolado de teste (0,5 Mc Farland) foi colocada sobre placa de ágar Muller-Hinton (MHA) e ceftazidima (30 µg) e Cefoxitina (30µg) foram colocados 20mm de centro a centro. As placas foram incubadas por 18 a 20 horas a 37 ° C. A indutibilidade da β-lactamase AmpC foi reconhecida por isolados mostrando diminuição da zona de inibição da ceftazidima adjacente ao disco de cefoxitina e foram considerados positivos na tela (12) (Tabela / Fig. 1) .
Teste tridimensional modificado (MTDT) A
confirmação da produção de β-lactamase AmpC foi realizada por teste tridimensional modificado (MTDT) conforme descrito por Manchanda et al (13).. Foram recolhidos 10-15 mg de crescimento fresco durante a noite a partir de ágar Muller Hinton (MHA) num tubo de ebulição estéril de 200 µl. Adicionou-se água de peptona e centrifugou-se a 800 g durante 15 minutos. Depois, por descongelamento por congelação repetida, durante cinco a sete vezes, preparou-se o extracto de enzima bruto. A cultura do gramado de E. coli ATCC 25922 foi feita em placas de MHA e o disco de cefoxitina (30 µg) foi colocado na placa. Uma fenda linear de 3 cm foi cortada usando uma lâmina de bisturi estéril a 3 mm do disco de cefoxitina. No outro extremo da fenda, um poço foi cortado. 30 de extracto de enzima bruto foram colocados no po e as placas foram incubadas.
Interpretação do MTDT:
Isolados mostrando clara distorção da zona de inibição foram tomados como produtores AmpC (Tabela / Fig 2). Isolados sem distorção da zona de inibição foram tomados como não produtores de AmpC. Isolados com mínima distorção foram tomados como cepas indeterminadas.
AmpC Disc Test A
produção de β-lactamase AmpC foi adicionalmente confirmada pelo teste de disco AmpC como descrito por Black et al (14) .
Tris EDTA foi usado para permeabilizar a célula bacteriana e liberação de β-lactamase no ambiente externo. Os discos AmpC foram preparados em casa. 20 de uma mistura 1: 1 de soluo salina esterilizada e 100X Tris-EDTA foram aplicados a um disco de papel de filtro esterilizado. Os discos foram deixados a secar e armazenados a 2-8 ° C. Antes do uso, os discos AmpC foram reidratados com 20 µl de solução salina estéril e 8-10 colônias de cepas de teste foram aplicadas a um disco. Uma cultura de gramado de E. coli ATCC 25922 foi feita em placa de ágar Muller Hinton (MHA). Um disco de cefoxitina (30 µg) colocado nesta placa MHA inoculada. O disco AmpC inoculado foi colocado quase tocando o disco de cefoxitina com a superfície do disco inoculado em contato com a superfície do ágar. As placas foram então incubadas durante a noite a 37 ° C.
Interpretação do Teste de Disco AmpC
Isolados mostrando uma indentação ou um embelezamento da zona de inibição indicando inativação enzimática de cefoxitina foram considerados positivos para a produção de AmpC (Tabela / Fig 3) , (Tabela / Fig. 4) .Isolatos não mostrando distorção indicando nenhuma inativação significativa de cefoxitina foram considerado negativo para produção de AmpC (14) .
Resultados
De 244 cepas de Pseudomonas aeruginosa estudadas para produção de β-lactamase AmpC indutível 47 (19,3%) foram positivas para todos os três métodos usados, ou seja, teste de antagonismo de disco, (12) MTDT (13) e teste de disco AmpC (14) (Tabela / Fig. 5) . Essas cepas de Pseudomonas aeruginosa foram positivas pelo teste de antagonismo discal, tela positiva, (Tabela / Fig 1), que foram confirmadas por MTDT (Tabela / Fig. 2) e teste de disco AmpC (Tabela / Fig 3) , (Tabela / Fig 4) . Por MTDT, 42 estirpes mostraram uma distorção clara da zona de inibição e foram tomadas como produtor de β-lactamase AmpC. 5 cepas apresentaram mínima distorção da zona de inibição e foram tomadas como cepas indeterminadas(Tabela / Fig 6) Através do teste do disco AmpC, 39 cepas mostraram indentação e 8 cepas mostraram uma zona de inibição lisonjeira. Todas as 47 cepas foram tomadas como produtor de β-lactamase AmpC pelo teste de disco AmpC. As 5 cepas indeterminadas exibindo mínima distorção também mostraram achatamento no teste de disco AmpC indicando produção fraca de AmpC (Tabela / Fig 6) .Dessas, 244 cepas de Pseudomonas aeruginosa 218 (89,3%) foram isoladas do departamento de pacientes internos (IPD) e 26 (10,7%) eram de pacientes de UTI. Nenhuma cepa de Pseudomonas aeruginosa foi isolada de pacientes do departamento de pacientes ao ar livre (OPD). Das 47 cepas de Pseudomonas aeruginosa produtoras de β-lactamase AmpC 2 (4,3%) foram de pacientes de UTI. Entre esses 2 pacientes internados em UTI, de 1 (2,1%) paciente, a linhagem isolada de Pseudomonas aeruginosa foi resistente a todos os antibióticos antipseudomônicos estudados. Outra cepa de Pseudomonas aeruginosa isolada de paciente de UTI também foi resistente a ciprofloxacina, piperacilina / tazobactam, aztreonam, cefepima, ceftazidima e netilmicina.
As cepas de Pseudomonas aeruginosa isoladas de diferentes espécimes foram: urina 82 (33,6%), pus 63 (25,9%), escarro 37 (15,1%), sangue 12 (5%), secreção do tubo endotraqueal 7 (2,9%) e outras 43 ( 17,6%). Das 47 estirpes de Pseudomonas aeruginosa produtoras de β-lactamase AmpC foram isoladas 21 estirpes (44,7%) isoladas da urina, seguidas de 12 (25,5%) de pus e 8 (17%) de expectoração respectivamente (Tabela / Fig. 7) . 225 (92,2%) cepas de Pseudomonas aeruginosa foram sensíveis a meropenem e imipenem, seguidas de 201 (82,4%) cepas sensíveis à amicacina e 184 (75,4%) cepas sensíveis à ciprofloxacina (Tabela / Fig 8).O padrão de sensibilidade mais elevado observado foi o Imipenem, Amicacina e Ciprofloxacina. 19 (7,8%) cepas de Pseudomonas aeruginosa foram resistentes a todos os 9 antibióticos antipseudomônicos mais recentes estudados, dos quais 3 (15,8%) cepas foram produtoras de β-lactamase AmpC.
Discussão
As bactérias produtoras de β-lactamase AmpC podem causar grandes falhas terapêuticas se não forem detectadas, pois no teste de difusão de Kirby-Bauer Disc para sensibilidade a antibióticos de rotina, elas podem mostrar uma zona de sensibilidade falsa. Mas os fatos são organismos produtores de β-lactamase AmpC, particularmente Pseudomonas aeruginosa está em ascensão e representa um grande desafio terapêutico devido à falha do tratamento (15) , e tem sido responsável por vários surtos nosocomiais. A principal ameaça é que as espécies E.coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca e Salmonella possam produzir β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos, tornando a maioria das cepas bacterianas resistentes à cefoxitina e outras cefalosporinas, mas a maioria dos laboratórios clínicos e médicos permanecem inconscientes da importância clínica do AmpC. organismo produtor de β-lactamases (16). A detecção de β-lactamases de espectro ampliado (ESBL) em espécies produtoras de bactérias gram-negativas produtoras de AmpC é outra área problemática importante. A expressão de alto nível de AmpC pode impedir o reconhecimento de uma abordagem ESBL especialmente se baseada em inibidor, ou seja, o ácido clavulânico é usado para detectar ESBL. A razão é que o ácido clavulânico pode atuar como indutor da produção de AmpC de alto nível nesses organismos, por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Serratia, Enterobacter sp. etc, que pode produzir AmpC β-lactamase (9) indutível codificada cromossomicamente .Mas há uma escassez de dados sobre a Pseudomonas aeruginosa produtora de β-lactamase AmpC indutível, não apenas na Índia, mas também no mundo. Nenhuma recomendação do Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) existe para triagem fenotípica ou testes confirmatórios para bactérias produtoras de β-lactamase AmpC indutíveis (17) . Os métodos de detecção actuais para detecção de organismos produtores de β-lactamase AmpC são tecnicamente exigentes. Embora o PCR multiplex tenha sido feito, ainda não está disponível para uso rotineiro (16) . No presente estudo, tivemos 19,3% de nossas cepas de Pseudomonas aeruginosa que produzem β-lactamases AmpC. Nosso estudo se correlacionou bem com relatos de Aligarh por Shahid et al. em 2004, 20% (17) e de Kolkata por Arora et al. em 2005 como 17,3% (15)e de Varanasi como 22% (18) . Bhattacharjee et al. da IMS, a UBS relatou que 94% de suas cepas de Pseudomonas aeruginosa eram sensíveis a Piperacilina / Tazobactum (18), mas em nosso estudo, apenas 71,7% das cepas eram sensíveis à piperacilina / Tazobactum. No presente estudo, o máximo de cepas (92,2%) foi sensível ao Meropenem e ao Imipenem, contra apenas 86% de sensibilidade ao imipenem no estudo realizado na UBS (18) .
Entre as 19 cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes a todos os antibióticos antipseudomônicos mais recentes estudados, 3 (15,8%) cepas foram produtoras de β-lactamases AmpC, e 16 (84,2%) eram resistentes a todos os antibióticos antipseudomônicos, mas AmpC β-lactamases negativas.
O teste tridimensional modificado (MTDT) não é viável para fazer rotineiramente, pois é complicado para a confirmação do produtor de β-lactamases AmpC. Em comparação com o MTDT, todas as cepas de Pseudomonas aeruginosa (100%) produtoras de β-lactamase AmpC puderam ser detectadas pelo teste de disco AmpC em nosso estudo. Deve ser esclarecido aqui que, embora o teste de disco AmpC tenha sido originalmente introduzido para detectar a β-lactamase AmpC mediada por plasmídeo, Black et al. relataram que o teste de disco AmpC detecta produção em alto nível de β-lactamase AmpC indutível por cromossomos em Pseudomonas aeruginosa, espécies de Acinetobacter, Enterobacter cloacae etc (14) .
Conclusão
Embora diretrizes específicas do CLSI não estejam disponíveis para a detecção de β-lactamases AmpC, os microbiologistas clínicos devem começar a triagem de cepas bacterianas produtoras de β-lactamase AmpC para evitar o uso indevido de antibióticos e falhas terapêuticas. Entre os diferentes métodos disponíveis, o teste de disco AmpC é bastante fácil, o que pode ser feito rotineiramente para detectar a produção de β-lactamases AmpC em qualquer laboratório de Microbiologia.Referências
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Endereço para correspondência :
Dr. S. Basak
Professor de Microbiologia
da Faculdade de Medicina J.
Sawangi (M), Wardha-442004 (MS)
E-mail: drsbasak1@yahoo.com.
Abstrato
Pseudomonas aeruginosa, um dos patógenos mais comuns que causam infecções nosocomiais, apresenta resistência crescente a antibióticos β-lactâmicos, especialmente pela produção de β-lactamases AmpC. Assim, este estudo foi realizado para determinar a prevalência de β-lactamases AmpC indutíveis produzindo Pseudomonas aeruginosa em nosso hospital e seu padrão de suscetibilidade a antibióticos antipseudomonal mais novos.Foram estudados 244 isolados de Pseudomonas aeruginosa. Os isolados que mostram o embotamento da zona de inibição da ceftazidima adjacente ao disco de cefoxitina foram considerados positivos na tela e foram selecionados para confirmação de β-lactamases AmpC indutíveis produzidas por teste tridimensional modificado e teste de disco AmpC. O padrão de suscetibilidade in vitro de antibióticos antipseudomonais foi feito pelo método de difusão em disco de Kirby Bauer.Dos 244 isolados de Pseudomonas aeruginosa, 47 (19,3%) foram positivos no teste, que foram confirmados pelo teste tridimensional modificado e pelo teste de disco AmpC. O padrão de sensibilidade mais elevado observado foi Imipenem, Amicacina e Ciprofloxacina.Concluímos que, para evitar o uso indevido de antibióticos e iniciar antibióticos adequados para pacientes hospitalizados, os testes para as β-lactamases AmpC devem ser feitos em laboratórios de Microbiologia Clínica.
Palavras-chave
Pseudomonas aeruginosa,? -Lactamase de AmpC indutel, teste de disco AmpC.
Como citar este artigo:
BASAK S, KHODKE M, BOSE S, MALLICK SK. INDUZIDA AMPC BETA-LACTAMASE PRODUZINDO PSEUDOMONAS AERUGINOSA ISOLADA EM UM HOSPITAL RURAL DA ÍNDIA CENTRAL. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2009 dezembro [citado: 2018 29 de agosto]; 3: 1921-1927. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=December&volume=3&issue=6&page=1921-1927&id=599
Introdução APseudomonas aeruginosa é um dos patógenos mais comuns que causam infecção nosocomial. É intrinsecamente resistente a muitos antibióticos, incluindo novos antibióticos β-lactâmicos, ou pode desenvolver resistência durante o tratamento, levando a alta mortalidade e morbidade.O mecanismo mais comum de resistência a antibióticos β-lactâmicos em bactérias Gram negativas é predominantemente devido à produção de β-lactamases que clivam o anel β-lactâmico estrutural. De acordo com a classificação da estrutura molecular de Ambler 1980, as principais classes de β-lactamases são A, C, D (1) .
Pseudomonas aeruginosa pode produzir todas as principais classes de β-lactamases (A, C, D) e também metalobetalactamases, ou seja, classe B. A exposição persistente de Pseudomonas aeruginosa a antibióticos β-lactâmicos leva à mutação e superprodução de AmpC ou β-lactamases de classe C. Estas são cefalosporinases que foram classificadas por Ambler em 1980 (1) como classe molecular C e de acordo com Bush et al (2) foram classificadas como Grupo I. As β-lactamases de AmpC conferem resistência a oximino- falfalosporinas, 7α metoxi-cefalosporinas (cefoxitina e cefotetan).
As β-lactamases AmpC que são mediadas cromossomicamente foram descritas em Acinetobacter sp, Morganella morganii, Citrobacter freundii, Enterobacter sp, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Serratia marcescens, E.coli, Hafnia alvei, etc. Na maioria destas bactérias AmpC é indutível via um sistema envolvendo ampD, ampG, ampR e intermediários na reciclagem de peptidoglicano (3) , (4) . O gene ampC de E. coli é normalmente expresso em um nível baixo, mas não induzido porque o ampR está ausente (5) .
As β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos surgiram através da transferência de genes cromossómicos de β-lactamases AmpC para plasmídeos (6).. As β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos foram encontradas em Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp, Proteus mirabilis e mesmo E. coli e foram relatadas pela primeira vez em 1988 (7) .
Actualmente, todas as β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos têm um perfil de substrato semelhante às β-lactamases AmpC cromossómicas. Mas a única diferença é que as β-lactamases AmpC cromossómicas são indutíveis quando as β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos não são indutíveis (8) .
As β-lactamases AmpC conferem resistência às cefalosporinas no grupo oxiiminm (ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona, ceftizoxima, cefuroxima) e no grupo 7-α-metoxi (cefoxitina, cefotetan, cefmetazole, moxalactam) e monobactum (azotrenam) e não são afetadas pela disponibilidade Inibidores da β-lactamase, ou seja, ácido clavulânico, sulbactum, etc.
Os organismos produtores de β-lactamases AmpC estão em ascensão e levam ao insucesso terapêutico se as cefalosporinas de 3ª Geração forem fornecidas empiricamente ou não testadas no laboratório para produção de β-lactamases AmpC. Especialmente, as β-lactamases de AmpC indutíveis podem ser induzidas a várias centenas de vezes mais altas na presença de ácido clavulânico, onde o ácido clavulânico é comumente usado como inibidor de β-lactamases de espectro ampliado (ESBL) (9) .
Objetivos e objetivos
O presente estudo foi realizado:
1. Determinar a prevalência de Pseudomonas aeruginosa produtora de β-lactamase AmpC induzível isolada em um hospital rural na Índia Central.
2. Detectar o padrão de suscetibilidade antibiótica das cepas de Pseudomonas aeruginosa a antibióticos antipseudomânicos mais novos.
Material e métodos
O estudo foi realizado por um período de um ano, de 1 de setembro de 2006 a 31 de agosto de 2007. Um total de 244 cepas de Pseudomonas aeruginosa foi isolado de diferentes amostras clínicas, por exemplo, urina, pus, escarro, sangue, secreções do tubo endotraqueal e outras em laboratório de Microbiologia. da Faculdade de Medicina Jawaharlal Nehru, Wardha (MS) e foram identificados de acordo com os métodos convencionais (10). Outros espécimes incluem swab da garganta, descarga da orelha, pontas do cateter, líquido peritoneal, swab vaginal, swab da mucosa bucal etc. Padrão de suscetibilidade antibiótica de isolados de Pseudomonas aeruginosa a antibióticos antipseudomânicos mais novos, por exemplo Meropenem (10µg), Imipenem (10µg), Amicacina (30µg) , ciprofloxacina (5), Pipercilina / Tazobacta (100/10), Azotrenam (30), Cefepima (30), Ceftazidima (30), Netilmicina (30), foram detectados pelo modo de difus em disco de Kirby-Bauer (11) . Os discos de antibiicos foram adquiridos a HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Índia. O rastreio da β-lactamase AmpC foi feito pelo teste de antagonismo de disco (12) . A confirmação da produção de β-lactamase AmpC foi feita por teste tridimensional modificado (MTDT) (13) e teste de disco AmpC (14) .Teste de Antiagonismo de DiscoNeste teste, a cultura de gramado do isolado de teste (0,5 Mc Farland) foi colocada sobre placa de ágar Muller-Hinton (MHA) e ceftazidima (30 µg) e Cefoxitina (30µg) foram colocados 20mm de centro a centro. As placas foram incubadas por 18 a 20 horas a 37 ° C. A indutibilidade da β-lactamase AmpC foi reconhecida por isolados mostrando diminuição da zona de inibição da ceftazidima adjacente ao disco de cefoxitina e foram considerados positivos na tela (12) (Tabela / Fig. 1) .
Teste tridimensional modificado (MTDT) A
confirmação da produção de β-lactamase AmpC foi realizada por teste tridimensional modificado (MTDT) conforme descrito por Manchanda et al (13).. Foram recolhidos 10-15 mg de crescimento fresco durante a noite a partir de ágar Muller Hinton (MHA) num tubo de ebulição estéril de 200 µl. Adicionou-se água de peptona e centrifugou-se a 800 g durante 15 minutos. Depois, por descongelamento por congelação repetida, durante cinco a sete vezes, preparou-se o extracto de enzima bruto. A cultura do gramado de E. coli ATCC 25922 foi feita em placas de MHA e o disco de cefoxitina (30 µg) foi colocado na placa. Uma fenda linear de 3 cm foi cortada usando uma lâmina de bisturi estéril a 3 mm do disco de cefoxitina. No outro extremo da fenda, um poço foi cortado. 30 de extracto de enzima bruto foram colocados no po e as placas foram incubadas.
Interpretação do MTDT:
Isolados mostrando clara distorção da zona de inibição foram tomados como produtores AmpC (Tabela / Fig 2). Isolados sem distorção da zona de inibição foram tomados como não produtores de AmpC. Isolados com mínima distorção foram tomados como cepas indeterminadas.
AmpC Disc Test A
produção de β-lactamase AmpC foi adicionalmente confirmada pelo teste de disco AmpC como descrito por Black et al (14) .
Tris EDTA foi usado para permeabilizar a célula bacteriana e liberação de β-lactamase no ambiente externo. Os discos AmpC foram preparados em casa. 20 de uma mistura 1: 1 de soluo salina esterilizada e 100X Tris-EDTA foram aplicados a um disco de papel de filtro esterilizado. Os discos foram deixados a secar e armazenados a 2-8 ° C. Antes do uso, os discos AmpC foram reidratados com 20 µl de solução salina estéril e 8-10 colônias de cepas de teste foram aplicadas a um disco. Uma cultura de gramado de E. coli ATCC 25922 foi feita em placa de ágar Muller Hinton (MHA). Um disco de cefoxitina (30 µg) colocado nesta placa MHA inoculada. O disco AmpC inoculado foi colocado quase tocando o disco de cefoxitina com a superfície do disco inoculado em contato com a superfície do ágar. As placas foram então incubadas durante a noite a 37 ° C.
Interpretação do Teste de Disco AmpC
Isolados mostrando uma indentação ou um embelezamento da zona de inibição indicando inativação enzimática de cefoxitina foram considerados positivos para a produção de AmpC (Tabela / Fig 3) , (Tabela / Fig. 4) .Isolatos não mostrando distorção indicando nenhuma inativação significativa de cefoxitina foram considerado negativo para produção de AmpC (14) .
Resultados
De 244 cepas de Pseudomonas aeruginosa estudadas para produção de β-lactamase AmpC indutível 47 (19,3%) foram positivas para todos os três métodos usados, ou seja, teste de antagonismo de disco, (12) MTDT (13) e teste de disco AmpC (14) (Tabela / Fig. 5) . Essas cepas de Pseudomonas aeruginosa foram positivas pelo teste de antagonismo discal, tela positiva, (Tabela / Fig 1), que foram confirmadas por MTDT (Tabela / Fig. 2) e teste de disco AmpC (Tabela / Fig 3) , (Tabela / Fig 4) . Por MTDT, 42 estirpes mostraram uma distorção clara da zona de inibição e foram tomadas como produtor de β-lactamase AmpC. 5 cepas apresentaram mínima distorção da zona de inibição e foram tomadas como cepas indeterminadas(Tabela / Fig 6) Através do teste do disco AmpC, 39 cepas mostraram indentação e 8 cepas mostraram uma zona de inibição lisonjeira. Todas as 47 cepas foram tomadas como produtor de β-lactamase AmpC pelo teste de disco AmpC. As 5 cepas indeterminadas exibindo mínima distorção também mostraram achatamento no teste de disco AmpC indicando produção fraca de AmpC (Tabela / Fig 6) .Dessas, 244 cepas de Pseudomonas aeruginosa 218 (89,3%) foram isoladas do departamento de pacientes internos (IPD) e 26 (10,7%) eram de pacientes de UTI. Nenhuma cepa de Pseudomonas aeruginosa foi isolada de pacientes do departamento de pacientes ao ar livre (OPD). Das 47 cepas de Pseudomonas aeruginosa produtoras de β-lactamase AmpC 2 (4,3%) foram de pacientes de UTI. Entre esses 2 pacientes internados em UTI, de 1 (2,1%) paciente, a linhagem isolada de Pseudomonas aeruginosa foi resistente a todos os antibióticos antipseudomônicos estudados. Outra cepa de Pseudomonas aeruginosa isolada de paciente de UTI também foi resistente a ciprofloxacina, piperacilina / tazobactam, aztreonam, cefepima, ceftazidima e netilmicina.As cepas de Pseudomonas aeruginosa isoladas de diferentes espécimes foram: urina 82 (33,6%), pus 63 (25,9%), escarro 37 (15,1%), sangue 12 (5%), secreção do tubo endotraqueal 7 (2,9%) e outras 43 ( 17,6%). Das 47 estirpes de Pseudomonas aeruginosa produtoras de β-lactamase AmpC foram isoladas 21 estirpes (44,7%) isoladas da urina, seguidas de 12 (25,5%) de pus e 8 (17%) de expectoração respectivamente (Tabela / Fig. 7) . 225 (92,2%) cepas de Pseudomonas aeruginosa foram sensíveis a meropenem e imipenem, seguidas de 201 (82,4%) cepas sensíveis à amicacina e 184 (75,4%) cepas sensíveis à ciprofloxacina (Tabela / Fig 8).O padrão de sensibilidade mais elevado observado foi o Imipenem, Amicacina e Ciprofloxacina. 19 (7,8%) cepas de Pseudomonas aeruginosa foram resistentes a todos os 9 antibióticos antipseudomônicos mais recentes estudados, dos quais 3 (15,8%) cepas foram produtoras de β-lactamase AmpC.
Discussão
As bactérias produtoras de β-lactamase AmpC podem causar grandes falhas terapêuticas se não forem detectadas, pois no teste de difusão de Kirby-Bauer Disc para sensibilidade a antibióticos de rotina, elas podem mostrar uma zona de sensibilidade falsa. Mas os fatos são organismos produtores de β-lactamase AmpC, particularmente Pseudomonas aeruginosa está em ascensão e representa um grande desafio terapêutico devido à falha do tratamento (15) , e tem sido responsável por vários surtos nosocomiais. A principal ameaça é que as espécies E.coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca e Salmonella possam produzir β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos, tornando a maioria das cepas bacterianas resistentes à cefoxitina e outras cefalosporinas, mas a maioria dos laboratórios clínicos e médicos permanecem inconscientes da importância clínica do AmpC. organismo produtor de β-lactamases (16). A detecção de β-lactamases de espectro ampliado (ESBL) em espécies produtoras de bactérias gram-negativas produtoras de AmpC é outra área problemática importante. A expressão de alto nível de AmpC pode impedir o reconhecimento de uma abordagem ESBL especialmente se baseada em inibidor, ou seja, o ácido clavulânico é usado para detectar ESBL. A razão é que o ácido clavulânico pode atuar como indutor da produção de AmpC de alto nível nesses organismos, por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Serratia, Enterobacter sp. etc, que pode produzir AmpC β-lactamase (9) indutível codificada cromossomicamente .Mas há uma escassez de dados sobre a Pseudomonas aeruginosa produtora de β-lactamase AmpC indutível, não apenas na Índia, mas também no mundo. Nenhuma recomendação do Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) existe para triagem fenotípica ou testes confirmatórios para bactérias produtoras de β-lactamase AmpC indutíveis (17) . Os métodos de detecção actuais para detecção de organismos produtores de β-lactamase AmpC são tecnicamente exigentes. Embora o PCR multiplex tenha sido feito, ainda não está disponível para uso rotineiro (16) . No presente estudo, tivemos 19,3% de nossas cepas de Pseudomonas aeruginosa que produzem β-lactamases AmpC. Nosso estudo se correlacionou bem com relatos de Aligarh por Shahid et al. em 2004, 20% (17) e de Kolkata por Arora et al. em 2005 como 17,3% (15)e de Varanasi como 22% (18) . Bhattacharjee et al. da IMS, a UBS relatou que 94% de suas cepas de Pseudomonas aeruginosa eram sensíveis a Piperacilina / Tazobactum (18), mas em nosso estudo, apenas 71,7% das cepas eram sensíveis à piperacilina / Tazobactum. No presente estudo, o máximo de cepas (92,2%) foi sensível ao Meropenem e ao Imipenem, contra apenas 86% de sensibilidade ao imipenem no estudo realizado na UBS (18) .Entre as 19 cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes a todos os antibióticos antipseudomônicos mais recentes estudados, 3 (15,8%) cepas foram produtoras de β-lactamases AmpC, e 16 (84,2%) eram resistentes a todos os antibióticos antipseudomônicos, mas AmpC β-lactamases negativas.
O teste tridimensional modificado (MTDT) não é viável para fazer rotineiramente, pois é complicado para a confirmação do produtor de β-lactamases AmpC. Em comparação com o MTDT, todas as cepas de Pseudomonas aeruginosa (100%) produtoras de β-lactamase AmpC puderam ser detectadas pelo teste de disco AmpC em nosso estudo. Deve ser esclarecido aqui que, embora o teste de disco AmpC tenha sido originalmente introduzido para detectar a β-lactamase AmpC mediada por plasmídeo, Black et al. relataram que o teste de disco AmpC detecta produção em alto nível de β-lactamase AmpC indutível por cromossomos em Pseudomonas aeruginosa, espécies de Acinetobacter, Enterobacter cloacae etc (14) .
Conclusão
Embora diretrizes específicas do CLSI não estejam disponíveis para a detecção de β-lactamases AmpC, os microbiologistas clínicos devem começar a triagem de cepas bacterianas produtoras de β-lactamase AmpC para evitar o uso indevido de antibióticos e falhas terapêuticas. Entre os diferentes métodos disponíveis, o teste de disco AmpC é bastante fácil, o que pode ser feito rotineiramente para detectar a produção de β-lactamases AmpC em qualquer laboratório de Microbiologia.Referências1.Ambler RP. A estrutura das β-lactamases. Philos.Trans.R.Soc.Lond. (Biol) 1980; 289: 321-31.2.Bush K. Classificação de β-lactamases: grupos 1, 2a, 2b e 2b. Antimicrob Agents Chemother 1989; 33: 264-70.3.Jacobs C, Fre're JM, Normark S. Intermediários citosólicos para a biossíntese da parede celular e controle de degradação da resistência β-lactama indutível em bactérias Gram negativas. Cell 1997; 88: 823-32.4.Wiedemann B, Dietz H, Pfeifle D. Indução de β-lactamases em Enterobacter cloacae. Clin Infect Dis 1998; 27 (supl. 1): 42-7.5.Honore N, Nicolas MH, Cole ST. A produção de cefalosporinase induzível em isolados clínicos de Enterobacter cloacae é controlada por um gene regulador que foi detectado a partir de Escherichia coli. EMBO J 1986; 5: 3709-14.6.Thomson KS. Controvérsias sobre espectro estendido e beta-lactamases AmpC. Emerg Infect Dis 2001; 7 (2): 333-6.7.Bauernfeind A, Chong Y, Schweighart S. β-lactamases de amplo espectro estendido em Klebsiella pneumoniae incluindo resistência a cefimicinas. Infection 1989; 17: 316-21.8.Barnaud G, Arlet G, Verdete C, Gaillot O, Lagrange PH, philippon A. Salmonella enteritidis: β-lactamases indutíveis mediadas por plasmídeo AmpC (DHA-1) com um gene ampR de Morganella morganii. Antimicrob. Agents Chemother 1998; 42: 2352-8.9.Thomson KS. Controvérsias sobre espectro estendido e beta-lactamases AmpC. Emerg Infect Dis 2001; 7 (2): 333-6.10.Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology 12ª ed. Seção 8, capítulo 24. In: Forbes AB, Sahm DF, Weissfeld AS, Editores. Edição Internacional Mosby Elsevier, 2007. P: 340-50.11.Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Jurek M. Teste de susceptibilidade antibiótica por um método único padronizado. Am J Clin Pathol 1966; 45: 493-96.12.Sanders CC, Sanders WE, Goering HV. Antagonismo in vitro de antibióticos β-lactâmicos pela cefoxitina. J Antimicrob chemother 1982; 21: 968-75.13.Manchanda V, Singh NP. Ocorrência e detecção de β-lactamases AmpC entre isolados clínicos Gram negativos usando um teste tridimensional modificado no Hospital Guru Tegh Bahadur, Delhi, Índia. J Antimicrob Chemother 2003; 51: 415-8.14.JA preto, Moland ES, Thomson KS. Teste de disco AmpC para detecção de β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos em Enterobacteriaceae sem as β-lactamases AmpC cromossómicas. J Clin Microbiol 2005: 43: 3110-3.15.B-lactamases de Arora S, Bal M. AmpC produzindo isolados bacterianos do hospital de Kolkata. Indian J Med Res 2005; 122: 224-33.16.JA preto, Thomson KS, Pitout JDD. Uso de inibidores de β-lactamases em testes de disco para detectar β-lactamases AmpC mediadas por plasmídeos. J Clin Microbiol 2004; 42 (5): 2203-6.17.Shahid S, Malik A, Agarwal M., Singhal S. Detecção fenotípica do espectro estendido e β-lactamases AmpC por um novo método de inoculação pontual e teste de extração tridimensional modificado: comparação com o teste tridimensional de extrato. J Antimicrob. Chemother 2004; 54: 684-7.18.Bhattacharjee A, Anuprabha S, Gaur A, Sen. Prevalência de β-lactamases AmpC indutíveis produtoras de Pseudomonas aeruginosa em um hospital terciário no norte da Índia. Ind J Med Microbiol 2008; 26 (1): 89-90.
