Produção de metalo-β-lactamase entre espécies de Pseudomonas e espécies de Acinetobacter em Karnatak
Professor, Departamento de Microbiologia, Melaka Manipal Medical College, **, *** Pós-graduando, Departamento de Microbiologia, Kasturba Medical College, Manipal, **** Professor, Departamento de Cirurgia, Kasturba Medical College, Manipal, ** *** professor do Departamento de Microbiologia do Melaka Manipal Medical College, Manipal
Correspondence Address :
Shobha K L
E.mail: shobhamicro@yahoo.com
Abstrato
Justificativa e objetivos: O surgimento da resistência a múltiplas drogas entre espécies de Pseudomonas e espécies de Acinetobacter é uma ameaça notável. A aquisição do gene da metalo-β-lactamase (MBL) é um importante mecanismo de resistência ao largo espectro de β-lactâmicos. O objetivo do estudo é detectar a prevalência de MBL entre Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. isoladas de várias amostras clínicas coletadas de diferentes faixas etárias.Materiais e métodos:Um total de 54 Pseudomonas spp. Resistentes ao meropenem. e Acinetobacter spp., testadas pelo método de difusão em disco, foram incluídas no estudo. As cepas foram isolados obtidos de queimaduras, úlceras, escarro e urina coletadas de pacientes com idade entre um ano e 90 anos. As cepas foram identificadas até o nível da espécie e o teste de sinergia com disco de EDTA foi utilizado, com testes simultâneos de diferentes β-lactâmicos (meropenem e aztreonam).Resultados:Das 54 cepas resistentes ao meropenem, 16 (30%) eram MBLs produzindo isolados, dos quais 13 (81%) eram isolados de amostras de pacientes do sexo masculino e 3 (19%) de pacientes do sexo feminino. Mais cepas de MBLs [13 (81%)] foram observadas na faixa etária de 40-75 anos e apenas algumas cepas de MBLs [3 (19%)] foram isoladas de amostras na faixa etária abaixo de 40 anos e acima de 75 anos . As MBLs foram mais prevalentes nos espécimes respiratórios 4 (45%) e menos prevalentes nos espécimes de urina 3 (21%) quando comparados com outros espécimes. Pseudomonas putida 7 (64%) apresentou maior número de MBLs produzindo organismos em comparação com outras espécies de Pseudomonas. Os isolados produtores de MBLs foram mais resistentes a Tobramicina [16 (100%)] e Gentamicina [15 (94%)] e foram menos resistentes à Piperacilina [10 (63%)] do que isolados sensíveis a meropenêmicos que não produziram MBLs.
Conclusão: A rápida discriminação dos produtores de MBL é preocupante e requer a implementação de não apenas estudos de vigilância, mas também a seleção adequada e criteriosa de antibióticos, especialmente os carbapenêmicos.
Palavras-chave
Metalo-β-lactamase, teste de sinergia com disco EDTA, carbapenemes
Como citar este artigo:
SHOBHA KL, LENKA PR, SHARMA MK, RAMACHANDRA L, BAIRIA I. PRODUÇÃO DE METALLO-β-LACTAMASE EM ESPÉCIES PSEUDOMONAS E ESPÉCIES ACINETOBACTERES EM KARNATAKA COSTAL. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2009 outubro [citado: 2018 29 de agosto]; 3: 1747-1753. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=October&volume=3&issue=5&page=1747-1753&id=579
Introdução
O surgimento da resistência a múltiplas drogas entre bactérias gram-negativas é uma ameaça notável. As espécies clinicamente relevantes de bacilos gram-negativos são frequentemente resistentes a antibióticos β-lactâmicos, incluindo cefalosporinas de espectro estendido, mas raramente a carbapenemas (2) . Os carbapenêmicos são frequentemente usados como antibióticos de último recurso no tratamento de infecções causadas por bacilos gram-negativos resistentes a múltiplos fármacos, pois são estáveis e respondem apenas ao espectro estendido e às β-lactamases AmpC.
No entanto, o surgimento de carbapenemases adquiridas, particularmente as metalo-β-lactamases de classe B da Ambler (MBLs), IMP e VIM, tem sido cada vez mais relatado na Ásia, Europa (2) , Canadá (5) e em muitas localizações geográficas (10). Outro tipo (SPM-1) foi relatado na América do Sul (9) . Cinco enzimas foram identificadas (tipos PIM, VIM, SPM, GIM e SIM) em vários organismos hospedeiros, sendo as mais comuns encontradas em Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp (3) . Pseudomonas aeruginosa produzindo metalo-β-lactamases (MBLs), foi relatada pela primeira vez no Japão em 1991 (5) e, em seguida, a resistência se espalhou para outras espécies. Recentemente, foram descritas na Europa as estirpes produtoras de Acinetobacter baumannii (14) e VIM-1 e VIM-2, produtoras de IMP-2, de P. aeruginosa (8).. Uma preocupação particular é que os genes da MBL adquiridos estão localizados em estruturas integradas que residem em elementos genéticos móveis, tais como plasmídeos ou transposons, permitindo assim ampla disseminação disseminada. A infecção clínica por esses organismos apresenta sérios desafios terapêuticos, com relatos crescentes de resultados desfavoráveis dos pacientes e morte (19) .
Com o aumento mundial da ocorrência, tipos e taxa de disseminação de MBLs, a detecção precoce é fundamental. Os benefícios de tal incluem a implementação oportuna de práticas rigorosas de controle de infecção, bem como orientação clínica sobre o risco potencial de falha terapêutica. Como observado com as β-lactamases de espectro estendido (ESBLs) e β-lactamases do tipo AmpC com cefalosporinas (12), a MBL portadora de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. pode parecer suscetível a carbapenêmicos usando os atuais pontos de ruptura do Clinical and Laboratory Standards Institute ou Sociedade Britânica de Quimioterapia Antimicrobiana (1) . Pitout e colegas relataram a presença de P.aeruginosa não suscetível a PIM em isolados clínicos e mostraram que 46% (110/241) das cepas eram positivas para MBL (13).. Achados semelhantes foram relatados por outros (15) .
Há dificuldade em detectar tais organismos, o que representa riscos significativos, particularmente devido ao seu papel na disseminação despercebida dentro das instituições e sua capacidade de participar da transferência gênica horizontal da MBL com outros organismos patogênicos relacionados ao hospital, pois os genes da MBL residem em cassetes gênicos móveis. integrons inseridos (16) . A detecção rápida de bacilos gram-negativos MBL-positivos é necessária para auxiliar no controle da infecção e prevenir sua disseminação (6) . Um método de PCR foi simples de usar na detecção de isolados produtores de MBL inicialmente (16), mas tornou-se mais difícil com o aumento do número de tipos de MBL (21) .
Atualmente, nenhum método padronizado para detecção de MBL foi proposto. Diversas técnicas não moleculares foram estudadas, todas aproveitando a dependência de zinco das enzimas, utilizando agentes quelantes como o EDTA ou o ácido 2-mercaptopropiônico para inibir suas atividades. O teste MBL-E comercialmente disponível é simples de executar, mas é altamente insensível na detecção de organismos portadores de MBL sensíveis a carbapenêmicos (3) e é caro. Além disso, foi descrita uma baixa especificidade com Acinetobacter baumannii resistente a carbapenem contendo blaoxA-23 (17) . Um teste de sinergia de disco duplo (DDST) usando imipenem (IPM) e EDTA 0,5M (9) e um teste de disco combinado usando dois discos IPM ou dois discos meropenem (MEM), um contendo 930µg (10)ou 750µg (15) de EDTA, foram ambos relatados como métodos confiáveis para a detecção de MBLs em cepas de Pseudomonas e Acinetobacter resistentes a carbapenêmicos. Quando o último método foi estudado usando isolados sensíveis a carbapenêmicos, a sensibilidade foi baixa, variando de 10% a 86% (22) . Até agora, nenhum método foi relatado para mostrar sensibilidade e especificidade adequadas para a detecção de isolados positivos para MBL resistentes a carbapenem. O objetivo deste estudo foi determinar a viabilidade do método que envolveu o uso de um disco MEM com EDTA adicionado para confirmar a presença de isolados clínicos de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp.
Material e métodos
Cepas bacterianas e isolar coleçãoIsolados consecutivos não-duplicados de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. que são resistentes a MEM (MIC> 8 µg / ml), foram retirados de vários espécimes clínicos, que incluíram amostras de feridas (purulentas), urina, amostras do trato respiratório, sangue e outros como líquido ascético, líquido sinovial, cotonete e ouvido swab, que foram coletados de pacientes e pacientes externos de vários departamentos. Os departamentos incluíram a enfermaria de remédios, a ala de cirurgia, a enfermaria pediátrica, a enfermaria ortopédica e a enfermaria de otorrinolaringologia do Hospital Kasturba Medical College (KMCH), Manipal, Índia e as amostras estudadas foram de pacientes que freqüentaram esses hospitais de fevereiro de 2007 a janeiro 2008. O número total de pacientes incluídos em nosso estudo foi 54, incluindo tanto homens (41/54) quanto mulheres (13/54). A faixa etária dos pacientes foi entre 1 ano e 90 anos. Foram isoladas 44 espécies de Pseudomonas e 10 espécies de Acinetobacter. As cepas foram identificadas até o nível das espécies de acordo com W.winn et al (2006). (20) (Tabela / Fig. 1) .
Teste de Suscetibilidade
Antimicrobiana O teste de susceptibilidade antimicrobiana foi realizado usando ágar Mueller-Hinton (MHA). O teste de susceptibilidade antimicrobiana dos seguintes fármacos foi determinado pelo método de difusão em disco de Kirby-Bauer: Piperacilina (PIP) (100µg), Ceftazidima (CAZ) (30µg), Ciprofloxacina (CIP) (5µg), Gentamicina (GEN) (10µg) e Tobramicina (TOB) (10). As cepas de controle de qualidade utilizadas para esta parte do estudo foram Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Durante todo o estudo, os resultados foram interpretados usando os critérios da Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para o método de difusão discal (14).. Antes da inoculao em agar de Mueller Hinton, as estirpes foram comparadas com as do tubo padr de McFarland no. 0,5. Os discos antibióticos utilizados neste estudo foram obtidos da Span Diagnostics Ltd. Surat, Índia.
Detecção Fenotípica de Mbls
Um método de detecção fenotípica de MBL foi projetado usando uma única placa de agar e é composto de três componentes (Tabela / Fig 2).(I) No teste de disco combinado, dois discos MEM (10 µg) (um contendo 10 µl de EDTA anidro a 0,1 M (292 µg)) foram colocados separados por 25mm (centro a centro). Um aumento no diâmetro da zona de> 4 mm em torno do disco MEM-EDTA em comparação com o disco MEM sozinho, foi considerado positivo para um MBL. (ii) No DDST, um disco MEM (10 µg) foi colocado 20 mm (centro a centro) de um disco em branco contendo 10 µl de EDTA 0,1 M (292 µg). O aumento da zona de inibição na área entre os dois discos foi considerado positivo para uma MBL (Tabela / Fig. 2). (iii) O componente final era um disco de aztreonam (30 µg). Dada a sensibilidade única das MBLs a este antibiótico, estudamos os tamanhos das zonas de inibição de todos os isolados para determinar a utilidade deste componente na detecção fenotípica de MBL. Os discos foram colocados na superfície da placa de agar de cultura de relva inoculada, como mostrado na (Tabela / Fig. 2) e as placas foram incubadas durante a noite a 37 ° C.
Resultados
Cepas Bacterianas ClínicasUm total de 54 isolados não duplicados de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. foram incluídos no estudo. Das 54 cepas não sensíveis da MEM, 14 (26%) foram isoladas da urina, 4 (8%) do sangue, 19 (35%) das feridas (purulentas), 9 (17%) das amostras do trato respiratório e restantes 8 (15%) de vários outros espécimes (como líquido ascético, líquido sinovial, cotonete e swab de ouvido). Das 54 cepas resistentes ao meropenem, 16 (30%) eram MBLs produzindo isolados, dos quais 13 (81%) eram isolados de amostras de pacientes do sexo masculino e 3 (19%) de pacientes do sexo feminino. A produção de MBLs foi mais observada [13 (81%)] na faixa etária de 40-75 anos e apenas poucas cepas de MBLs foram isoladas das amostras [3 (19%)] na faixa etária abaixo de 40 anos e acima de 75 anos . (Tabela / Fig 3) Os isolados produtores de MBLs foram mais prevalentes nos espécimes respiratórios 4 (45%) e menos prevalentes nos espécimes de urina 3 (21%). Pseudomonas putida 7 (64%) foi encontrada mais em organismos produtores de MBLs (Tabela / Fig. 1) .
Suscetibilidades antimicrobianas de cepas clínicas
Dos 54 isolados clínicos incluídos neste estudo, 40 (74%) eram resistentes à PIP, 46 (85%) a CAZ, 53 (98%) a TOB, 48 (89%) a GEN e 49 (91%) para a CIP. Os isolados produtores de MBLs foram mais resistentes ao TOB [16 (100%)], GEN [15 (94%)], CIP [14 (88%)] e CAZ [14 (88%)] e foram menos resistentes ao PIP [ 10 (63%)] do que os isolados não sensíveis ao MEM que não produziram MBLs (Tabela / Fig. 4). Uma característica particularmente importante foi que todos os produtores de MBL eram resistentes ao TOB em comparação com 97% dos isolados não sensíveis ao MEM que não produziam MBLs (Tabela / Fig. 4) .
Discussão
As MBLs foram identificadas a partir de isolados clínicos em todo o mundo, com uma frequência crescente nos últimos anos e cepas produtoras dessas enzimas foram responsáveis por surtos nosocomiais prolongados que foram acompanhados por infecções graves, como relatado por Senda K, et al (1996) (15 ) . ) . Um estudo controlado por casos do Japão mostrou que pacientes infectados com P. aeruginosa produtora de MBL eram mais propensos a receber múltiplos antibióticos e, mais importante, que mortes relacionadas à infecção devido a P. aeruginosa produtoras de IMP eram mais freqüentes do que mortes causadas por blaIMP P. aeruginosa negativa, como relatado por Hirakata et al (2006) (7). A ocorrência de um isolado positivo para MBL em um ambiente hospitalar apresenta um problema terapêutico, bem como uma séria preocupação com o controle do controle de infecção. A identificação precisa e o relato de P. aeruginosa produtora de MBL auxiliará os profissionais de controle de infecção na prevenção da disseminação desses isolados multirresistentes, conforme relatado por Senda et al (1996) (15) . Acinetobacter spp. também é notório, tanto por sua capacidade de adquirir resistência a antibióticos quanto pela capacidade de algumas cepas, principalmente cepas de A. baumannii, de causar surtos nosocomiais. Portanto, a detecção precoce de laboratório é de grande importância clínica.Nosso estudo incluiu o uso da metodologia de disco CLSI que desenvolveu um teste de tela de disco EDTA com discos MEM sozinhos e em combinação com 292 µg de EDTA e Aztreonam (30 µg) por disco. Todas as três metodologias apresentaram resultados positivos para as mesmas 16 linhagens. Os métodos acima foram simples de realizar e os materiais utilizados foram baratos, não tóxicos e de fácil acesso, tornando-se altamente aplicáveis aos laboratórios clínicos de rotina. Em um estudo similar de Pitout et al. (2005) (13), eles mostraram que os resultados com MEM sozinho e em combinação com EDTA mostraram 100% de sensibilidade e 97% de especificidade na detecção de estirpes clínicas de P. aeruginosa produtoras de MBL bem caracterizadas e que este teste funcionou melhor do que o IPM e o teste MBL-E . PCR foi o método mais simples que foi usado na detecção de isolados produtores de MBL. Inicialmente Senda et al (1996) (16) usaram este método, mas tornou-se mais difícil para Yong DK .Lee et al (2002) (21)para usá-lo, devido ao aumento do número de tipos de MBL. No entanto, recomendamos que MEM seja usado como substrato para o teste de tela de disco EDTA. Os discos MEM-EDTA podem ser armazenados a 4 ou -20 durante 12 a 16 semanas sem perda significativa de actividade, como sugerido por Yong DK .Lee et al (2002) (21). O teste de tela de disco EDTA é simples de executar e interpretar e, uma vez que usa a metodologia CLSI, pode ser facilmente introduzido no fluxo de trabalho de um laboratório clínico.
Este estudo ilustra que os isolados de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. são causas importantes de resistência a MEM entre estas espécies que foram isoladas em nosso hospital (Tabela / Fig. 1). Das 54 cepas resistentes ao meropenem, 16 (30%) eram MBLs produzindo isolados, dos quais 13 (81%) eram isolados de amostras de pacientes do sexo masculino e 3 (19%) de pacientes do sexo feminino. A produção de MBLs foi mais observada [13 (81%)] na faixa etária de 40-75 anos e apenas algumas cepas de MBLs foram isoladas das amostras [3 (19%)] na faixa etária abaixo de 40 anos e acima 75 anos. Os isolados produtores de MBL foram mais resistentes a vários agentes antimicrobianos (Tabela / Fig. 4) e foram mais prevalentes em amostras respiratórias 4 (45%) do que em isolados resistentes a MEM que não produziram MBLs. Clare Franklin et al (2006) (3), em seu estudo, relataram a presença de maior número de isolados produtores de MBL em espécimes do trato respiratório do que em outros espécimes. Nossos resultados suportam a noção de que os laboratórios de microbiologia clínica devem ser capazes de distinguir as Pseudomonas spp. Produtoras de MBL. e Acinetobacter spp. de cepas com outros mecanismos que são responsáveis pela resistência a carbapenêmicos. A resistência a outros agentes antimicrobianos, como a Tobramicina, foi de 100% e a resistência à Gentamicina foi de 94%. Isso foi em concordância com o estudo conduzido por BV .Navaneeth et al (2004) (11), onde foi observado que a resistência à piperacilina-tazobactum, cefoperazona-sulbactam e ácido ticarcilina-clavulânico foi de 12%, 20% e 36%, respectivamente. Na ausência de novos agentes para o tratamento de infecções causadas por bactérias gram-negativas multirresistentes em um futuro próximo, a disseminação descontrolada de produtores de MBL pode levar a falhas no tratamento, com aumento da morbidade e mortalidade. A detecção precoce de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. podem evitar a disseminação futura desses isolados multirresistentes.
Conclusão
O surgimento de cepas produtoras de carbapenamase representa um sério problema terapêutico e epidemiológico, que pode ser contornado apenas pela detecção precoce e controle de patógenos multirresistentes. A detecção rápida de carbapenemases e de isolados de produção de metalo-β-lactamase deve ser acompanhada em laboratório de rotina, uma vez que o número de isolados produtores de metalo-β-lactamases está aumentando e representa um problema para os clínicos durante o tratamento de pacientes. A detecção rotineira de MBLs garantirá o melhor atendimento ao paciente e a introdução oportuna de procedimentos adequados de controle de infecção.Referências1.Andrews JM .. Teste de sensibilidade ao disco padronizado BSAC metho (versão 4) .J. Antimicrob. Chemother 2005; 56: 60–76.2.Chu YW, Afzal-Shah M, ET S Houang, M. F. Palepou, DJ Lyon, N Woodford e DM Livermore. IMP-4, uma nova metalo-β-lactamase de Acinetobacter spp nosocomial. recolhidos em Hong Kong entre 1994 e 1998. Antimicrob. Agentes Chemother. 2001; 45: 710-14.3.Clare Franklin, Lisa Liolios, Anton Y. Peleg. Detecção fenotípica de bacilos gram-negativos produtores de metalo-β-lactamases sensíveis a carbapenêmicos em laboratório clínico. J.Clin.Microbial. 2006; 44: 3139-44.4.Fluit AC, FT Schmitz. Integrons de classe 1, cassetes genéticos, mobilidade e epidemiologia. EUR. J. Clin. Microbiol. Infectar. Dis 1999; 18: 761-705.Gibb AP, C Tribuddharat, RA. Moore, TJ Louie, W Krulicki, DM Livermore, M.-FI. Palepou, N Woodford. Surto nosocomial de Pseudomonas aeruginosa resistente a carbapenêmicos com um novo alelo blaIMP, blaIMP-7. Antimicrob. Agentes Chemother. 2002; 46: 255–586.Hirakata Y, K Izumikawa, Yamaguchi T, Takemura H, H Tanaka, Yoshida R, J. Matsuda, Nakano M, K Tomono, Maesaki S, Kaku M, YYamada, S Kamihira, S. Kohno. Rápida detecção e avaliação de características clínicas de bastonetes gram-negativos resistentes a múltiplos fármacos, portadores do gene da metalo-β-lactamase blaIMP. Antimicrob. Agentes Chemother. 1998; 42: 2006–11.7.Hirakata, Y., T. Yamaguchi, M. Nakano, K. Izumikawa, M. mina, S. Aoki, A.Kondoh, J. Matsuda, M. Hirayama, K. Yanagihara, Y. Miyazaki, K. Tomono, Y .Yamada, S. Kamihira, S. Kohno .. As características clínicas e bacteriológicas de PIM-tipo metalo-beta-lactamase produtora de Pseudomonas aeruginosa Clin Infect Dis 2003; 37: .... 26-32.
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Abstrato
Justificativa e objetivos: O surgimento da resistência a múltiplas drogas entre espécies de Pseudomonas e espécies de Acinetobacter é uma ameaça notável. A aquisição do gene da metalo-β-lactamase (MBL) é um importante mecanismo de resistência ao largo espectro de β-lactâmicos. O objetivo do estudo é detectar a prevalência de MBL entre Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. isoladas de várias amostras clínicas coletadas de diferentes faixas etárias.Materiais e métodos:Um total de 54 Pseudomonas spp. Resistentes ao meropenem. e Acinetobacter spp., testadas pelo método de difusão em disco, foram incluídas no estudo. As cepas foram isolados obtidos de queimaduras, úlceras, escarro e urina coletadas de pacientes com idade entre um ano e 90 anos. As cepas foram identificadas até o nível da espécie e o teste de sinergia com disco de EDTA foi utilizado, com testes simultâneos de diferentes β-lactâmicos (meropenem e aztreonam).Resultados:Das 54 cepas resistentes ao meropenem, 16 (30%) eram MBLs produzindo isolados, dos quais 13 (81%) eram isolados de amostras de pacientes do sexo masculino e 3 (19%) de pacientes do sexo feminino. Mais cepas de MBLs [13 (81%)] foram observadas na faixa etária de 40-75 anos e apenas algumas cepas de MBLs [3 (19%)] foram isoladas de amostras na faixa etária abaixo de 40 anos e acima de 75 anos . As MBLs foram mais prevalentes nos espécimes respiratórios 4 (45%) e menos prevalentes nos espécimes de urina 3 (21%) quando comparados com outros espécimes. Pseudomonas putida 7 (64%) apresentou maior número de MBLs produzindo organismos em comparação com outras espécies de Pseudomonas. Os isolados produtores de MBLs foram mais resistentes a Tobramicina [16 (100%)] e Gentamicina [15 (94%)] e foram menos resistentes à Piperacilina [10 (63%)] do que isolados sensíveis a meropenêmicos que não produziram MBLs.Conclusão: A rápida discriminação dos produtores de MBL é preocupante e requer a implementação de não apenas estudos de vigilância, mas também a seleção adequada e criteriosa de antibióticos, especialmente os carbapenêmicos.
Palavras-chave
Metalo-β-lactamase, teste de sinergia com disco EDTA, carbapenemes
Como citar este artigo:
SHOBHA KL, LENKA PR, SHARMA MK, RAMACHANDRA L, BAIRIA I. PRODUÇÃO DE METALLO-β-LACTAMASE EM ESPÉCIES PSEUDOMONAS E ESPÉCIES ACINETOBACTERES EM KARNATAKA COSTAL. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2009 outubro [citado: 2018 29 de agosto]; 3: 1747-1753. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=October&volume=3&issue=5&page=1747-1753&id=579
IntroduçãoO surgimento da resistência a múltiplas drogas entre bactérias gram-negativas é uma ameaça notável. As espécies clinicamente relevantes de bacilos gram-negativos são frequentemente resistentes a antibióticos β-lactâmicos, incluindo cefalosporinas de espectro estendido, mas raramente a carbapenemas (2) . Os carbapenêmicos são frequentemente usados como antibióticos de último recurso no tratamento de infecções causadas por bacilos gram-negativos resistentes a múltiplos fármacos, pois são estáveis e respondem apenas ao espectro estendido e às β-lactamases AmpC.
No entanto, o surgimento de carbapenemases adquiridas, particularmente as metalo-β-lactamases de classe B da Ambler (MBLs), IMP e VIM, tem sido cada vez mais relatado na Ásia, Europa (2) , Canadá (5) e em muitas localizações geográficas (10). Outro tipo (SPM-1) foi relatado na América do Sul (9) . Cinco enzimas foram identificadas (tipos PIM, VIM, SPM, GIM e SIM) em vários organismos hospedeiros, sendo as mais comuns encontradas em Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp (3) . Pseudomonas aeruginosa produzindo metalo-β-lactamases (MBLs), foi relatada pela primeira vez no Japão em 1991 (5) e, em seguida, a resistência se espalhou para outras espécies. Recentemente, foram descritas na Europa as estirpes produtoras de Acinetobacter baumannii (14) e VIM-1 e VIM-2, produtoras de IMP-2, de P. aeruginosa (8).. Uma preocupação particular é que os genes da MBL adquiridos estão localizados em estruturas integradas que residem em elementos genéticos móveis, tais como plasmídeos ou transposons, permitindo assim ampla disseminação disseminada. A infecção clínica por esses organismos apresenta sérios desafios terapêuticos, com relatos crescentes de resultados desfavoráveis dos pacientes e morte (19) .
Com o aumento mundial da ocorrência, tipos e taxa de disseminação de MBLs, a detecção precoce é fundamental. Os benefícios de tal incluem a implementação oportuna de práticas rigorosas de controle de infecção, bem como orientação clínica sobre o risco potencial de falha terapêutica. Como observado com as β-lactamases de espectro estendido (ESBLs) e β-lactamases do tipo AmpC com cefalosporinas (12), a MBL portadora de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. pode parecer suscetível a carbapenêmicos usando os atuais pontos de ruptura do Clinical and Laboratory Standards Institute ou Sociedade Britânica de Quimioterapia Antimicrobiana (1) . Pitout e colegas relataram a presença de P.aeruginosa não suscetível a PIM em isolados clínicos e mostraram que 46% (110/241) das cepas eram positivas para MBL (13).. Achados semelhantes foram relatados por outros (15) .
Há dificuldade em detectar tais organismos, o que representa riscos significativos, particularmente devido ao seu papel na disseminação despercebida dentro das instituições e sua capacidade de participar da transferência gênica horizontal da MBL com outros organismos patogênicos relacionados ao hospital, pois os genes da MBL residem em cassetes gênicos móveis. integrons inseridos (16) . A detecção rápida de bacilos gram-negativos MBL-positivos é necessária para auxiliar no controle da infecção e prevenir sua disseminação (6) . Um método de PCR foi simples de usar na detecção de isolados produtores de MBL inicialmente (16), mas tornou-se mais difícil com o aumento do número de tipos de MBL (21) .
Atualmente, nenhum método padronizado para detecção de MBL foi proposto. Diversas técnicas não moleculares foram estudadas, todas aproveitando a dependência de zinco das enzimas, utilizando agentes quelantes como o EDTA ou o ácido 2-mercaptopropiônico para inibir suas atividades. O teste MBL-E comercialmente disponível é simples de executar, mas é altamente insensível na detecção de organismos portadores de MBL sensíveis a carbapenêmicos (3) e é caro. Além disso, foi descrita uma baixa especificidade com Acinetobacter baumannii resistente a carbapenem contendo blaoxA-23 (17) . Um teste de sinergia de disco duplo (DDST) usando imipenem (IPM) e EDTA 0,5M (9) e um teste de disco combinado usando dois discos IPM ou dois discos meropenem (MEM), um contendo 930µg (10)ou 750µg (15) de EDTA, foram ambos relatados como métodos confiáveis para a detecção de MBLs em cepas de Pseudomonas e Acinetobacter resistentes a carbapenêmicos. Quando o último método foi estudado usando isolados sensíveis a carbapenêmicos, a sensibilidade foi baixa, variando de 10% a 86% (22) . Até agora, nenhum método foi relatado para mostrar sensibilidade e especificidade adequadas para a detecção de isolados positivos para MBL resistentes a carbapenem. O objetivo deste estudo foi determinar a viabilidade do método que envolveu o uso de um disco MEM com EDTA adicionado para confirmar a presença de isolados clínicos de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp.
Material e métodos
Cepas bacterianas e isolar coleçãoIsolados consecutivos não-duplicados de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. que são resistentes a MEM (MIC> 8 µg / ml), foram retirados de vários espécimes clínicos, que incluíram amostras de feridas (purulentas), urina, amostras do trato respiratório, sangue e outros como líquido ascético, líquido sinovial, cotonete e ouvido swab, que foram coletados de pacientes e pacientes externos de vários departamentos. Os departamentos incluíram a enfermaria de remédios, a ala de cirurgia, a enfermaria pediátrica, a enfermaria ortopédica e a enfermaria de otorrinolaringologia do Hospital Kasturba Medical College (KMCH), Manipal, Índia e as amostras estudadas foram de pacientes que freqüentaram esses hospitais de fevereiro de 2007 a janeiro 2008. O número total de pacientes incluídos em nosso estudo foi 54, incluindo tanto homens (41/54) quanto mulheres (13/54). A faixa etária dos pacientes foi entre 1 ano e 90 anos. Foram isoladas 44 espécies de Pseudomonas e 10 espécies de Acinetobacter. As cepas foram identificadas até o nível das espécies de acordo com W.winn et al (2006). (20) (Tabela / Fig. 1) .Teste de Suscetibilidade
Antimicrobiana O teste de susceptibilidade antimicrobiana foi realizado usando ágar Mueller-Hinton (MHA). O teste de susceptibilidade antimicrobiana dos seguintes fármacos foi determinado pelo método de difusão em disco de Kirby-Bauer: Piperacilina (PIP) (100µg), Ceftazidima (CAZ) (30µg), Ciprofloxacina (CIP) (5µg), Gentamicina (GEN) (10µg) e Tobramicina (TOB) (10). As cepas de controle de qualidade utilizadas para esta parte do estudo foram Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Durante todo o estudo, os resultados foram interpretados usando os critérios da Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para o método de difusão discal (14).. Antes da inoculao em agar de Mueller Hinton, as estirpes foram comparadas com as do tubo padr de McFarland no. 0,5. Os discos antibióticos utilizados neste estudo foram obtidos da Span Diagnostics Ltd. Surat, Índia.
Detecção Fenotípica de Mbls
Um método de detecção fenotípica de MBL foi projetado usando uma única placa de agar e é composto de três componentes (Tabela / Fig 2).(I) No teste de disco combinado, dois discos MEM (10 µg) (um contendo 10 µl de EDTA anidro a 0,1 M (292 µg)) foram colocados separados por 25mm (centro a centro). Um aumento no diâmetro da zona de> 4 mm em torno do disco MEM-EDTA em comparação com o disco MEM sozinho, foi considerado positivo para um MBL. (ii) No DDST, um disco MEM (10 µg) foi colocado 20 mm (centro a centro) de um disco em branco contendo 10 µl de EDTA 0,1 M (292 µg). O aumento da zona de inibição na área entre os dois discos foi considerado positivo para uma MBL (Tabela / Fig. 2). (iii) O componente final era um disco de aztreonam (30 µg). Dada a sensibilidade única das MBLs a este antibiótico, estudamos os tamanhos das zonas de inibição de todos os isolados para determinar a utilidade deste componente na detecção fenotípica de MBL. Os discos foram colocados na superfície da placa de agar de cultura de relva inoculada, como mostrado na (Tabela / Fig. 2) e as placas foram incubadas durante a noite a 37 ° C.
Resultados
Cepas Bacterianas ClínicasUm total de 54 isolados não duplicados de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. foram incluídos no estudo. Das 54 cepas não sensíveis da MEM, 14 (26%) foram isoladas da urina, 4 (8%) do sangue, 19 (35%) das feridas (purulentas), 9 (17%) das amostras do trato respiratório e restantes 8 (15%) de vários outros espécimes (como líquido ascético, líquido sinovial, cotonete e swab de ouvido). Das 54 cepas resistentes ao meropenem, 16 (30%) eram MBLs produzindo isolados, dos quais 13 (81%) eram isolados de amostras de pacientes do sexo masculino e 3 (19%) de pacientes do sexo feminino. A produção de MBLs foi mais observada [13 (81%)] na faixa etária de 40-75 anos e apenas poucas cepas de MBLs foram isoladas das amostras [3 (19%)] na faixa etária abaixo de 40 anos e acima de 75 anos . (Tabela / Fig 3) Os isolados produtores de MBLs foram mais prevalentes nos espécimes respiratórios 4 (45%) e menos prevalentes nos espécimes de urina 3 (21%). Pseudomonas putida 7 (64%) foi encontrada mais em organismos produtores de MBLs (Tabela / Fig. 1) .Suscetibilidades antimicrobianas de cepas clínicas
Dos 54 isolados clínicos incluídos neste estudo, 40 (74%) eram resistentes à PIP, 46 (85%) a CAZ, 53 (98%) a TOB, 48 (89%) a GEN e 49 (91%) para a CIP. Os isolados produtores de MBLs foram mais resistentes ao TOB [16 (100%)], GEN [15 (94%)], CIP [14 (88%)] e CAZ [14 (88%)] e foram menos resistentes ao PIP [ 10 (63%)] do que os isolados não sensíveis ao MEM que não produziram MBLs (Tabela / Fig. 4). Uma característica particularmente importante foi que todos os produtores de MBL eram resistentes ao TOB em comparação com 97% dos isolados não sensíveis ao MEM que não produziam MBLs (Tabela / Fig. 4) .
Discussão
As MBLs foram identificadas a partir de isolados clínicos em todo o mundo, com uma frequência crescente nos últimos anos e cepas produtoras dessas enzimas foram responsáveis por surtos nosocomiais prolongados que foram acompanhados por infecções graves, como relatado por Senda K, et al (1996) (15 ) . ) . Um estudo controlado por casos do Japão mostrou que pacientes infectados com P. aeruginosa produtora de MBL eram mais propensos a receber múltiplos antibióticos e, mais importante, que mortes relacionadas à infecção devido a P. aeruginosa produtoras de IMP eram mais freqüentes do que mortes causadas por blaIMP P. aeruginosa negativa, como relatado por Hirakata et al (2006) (7). A ocorrência de um isolado positivo para MBL em um ambiente hospitalar apresenta um problema terapêutico, bem como uma séria preocupação com o controle do controle de infecção. A identificação precisa e o relato de P. aeruginosa produtora de MBL auxiliará os profissionais de controle de infecção na prevenção da disseminação desses isolados multirresistentes, conforme relatado por Senda et al (1996) (15) . Acinetobacter spp. também é notório, tanto por sua capacidade de adquirir resistência a antibióticos quanto pela capacidade de algumas cepas, principalmente cepas de A. baumannii, de causar surtos nosocomiais. Portanto, a detecção precoce de laboratório é de grande importância clínica.Nosso estudo incluiu o uso da metodologia de disco CLSI que desenvolveu um teste de tela de disco EDTA com discos MEM sozinhos e em combinação com 292 µg de EDTA e Aztreonam (30 µg) por disco. Todas as três metodologias apresentaram resultados positivos para as mesmas 16 linhagens. Os métodos acima foram simples de realizar e os materiais utilizados foram baratos, não tóxicos e de fácil acesso, tornando-se altamente aplicáveis aos laboratórios clínicos de rotina. Em um estudo similar de Pitout et al. (2005) (13), eles mostraram que os resultados com MEM sozinho e em combinação com EDTA mostraram 100% de sensibilidade e 97% de especificidade na detecção de estirpes clínicas de P. aeruginosa produtoras de MBL bem caracterizadas e que este teste funcionou melhor do que o IPM e o teste MBL-E . PCR foi o método mais simples que foi usado na detecção de isolados produtores de MBL. Inicialmente Senda et al (1996) (16) usaram este método, mas tornou-se mais difícil para Yong DK .Lee et al (2002) (21)para usá-lo, devido ao aumento do número de tipos de MBL. No entanto, recomendamos que MEM seja usado como substrato para o teste de tela de disco EDTA. Os discos MEM-EDTA podem ser armazenados a 4 ou -20 durante 12 a 16 semanas sem perda significativa de actividade, como sugerido por Yong DK .Lee et al (2002) (21). O teste de tela de disco EDTA é simples de executar e interpretar e, uma vez que usa a metodologia CLSI, pode ser facilmente introduzido no fluxo de trabalho de um laboratório clínico.Este estudo ilustra que os isolados de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. são causas importantes de resistência a MEM entre estas espécies que foram isoladas em nosso hospital (Tabela / Fig. 1). Das 54 cepas resistentes ao meropenem, 16 (30%) eram MBLs produzindo isolados, dos quais 13 (81%) eram isolados de amostras de pacientes do sexo masculino e 3 (19%) de pacientes do sexo feminino. A produção de MBLs foi mais observada [13 (81%)] na faixa etária de 40-75 anos e apenas algumas cepas de MBLs foram isoladas das amostras [3 (19%)] na faixa etária abaixo de 40 anos e acima 75 anos. Os isolados produtores de MBL foram mais resistentes a vários agentes antimicrobianos (Tabela / Fig. 4) e foram mais prevalentes em amostras respiratórias 4 (45%) do que em isolados resistentes a MEM que não produziram MBLs. Clare Franklin et al (2006) (3), em seu estudo, relataram a presença de maior número de isolados produtores de MBL em espécimes do trato respiratório do que em outros espécimes. Nossos resultados suportam a noção de que os laboratórios de microbiologia clínica devem ser capazes de distinguir as Pseudomonas spp. Produtoras de MBL. e Acinetobacter spp. de cepas com outros mecanismos que são responsáveis pela resistência a carbapenêmicos. A resistência a outros agentes antimicrobianos, como a Tobramicina, foi de 100% e a resistência à Gentamicina foi de 94%. Isso foi em concordância com o estudo conduzido por BV .Navaneeth et al (2004) (11), onde foi observado que a resistência à piperacilina-tazobactum, cefoperazona-sulbactam e ácido ticarcilina-clavulânico foi de 12%, 20% e 36%, respectivamente. Na ausência de novos agentes para o tratamento de infecções causadas por bactérias gram-negativas multirresistentes em um futuro próximo, a disseminação descontrolada de produtores de MBL pode levar a falhas no tratamento, com aumento da morbidade e mortalidade. A detecção precoce de Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp. podem evitar a disseminação futura desses isolados multirresistentes.
Conclusão
O surgimento de cepas produtoras de carbapenamase representa um sério problema terapêutico e epidemiológico, que pode ser contornado apenas pela detecção precoce e controle de patógenos multirresistentes. A detecção rápida de carbapenemases e de isolados de produção de metalo-β-lactamase deve ser acompanhada em laboratório de rotina, uma vez que o número de isolados produtores de metalo-β-lactamases está aumentando e representa um problema para os clínicos durante o tratamento de pacientes. A detecção rotineira de MBLs garantirá o melhor atendimento ao paciente e a introdução oportuna de procedimentos adequados de controle de infecção.Referências1.Andrews JM .. Teste de sensibilidade ao disco padronizado BSAC metho (versão 4) .J. Antimicrob. Chemother 2005; 56: 60–76.2.Chu YW, Afzal-Shah M, ET S Houang, M. F. Palepou, DJ Lyon, N Woodford e DM Livermore. IMP-4, uma nova metalo-β-lactamase de Acinetobacter spp nosocomial. recolhidos em Hong Kong entre 1994 e 1998. Antimicrob. 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