AmpC Beta Lactamases Entre ESBL Produzindo Escherichia Coli E Klebsiella Pneumoniae- Se Você Não Olh
Endereço para correspondência :
Dr.KEVandana, (MD)
Asso. Prof., Departamento de Microbiologia,
Faculdade de Medicina Kasturba, Manipal,
Udupi, 576104 Karnataka, (Índia).
Ph: 0820-2922322,9902206009
E-mail: vandanake@yahoo.co.in
Abstrato
As beta-lactamases da Amp C conferem resistência a uma ampla variedade de beta lactamas e representam desafios diagnósticos e terapêuticos, já que sua presença não é detectada na presença de ESBLs. Foram avaliados 52 isolados clínicos positivos para ESBL de E. coli (n = 41) e K.pneumoniae (n = 11) para produção de AmpC por um disco de ácido fenilborônico (PBA) e o teste de enzima tridimensional (3DET). O método PBA detectou 24 (58,5%) e 9 (82%) isolados de E. coli e K.pneumoniae como AmpC positivos, enquanto a detecção pelo 3DET aumentou os números para 29 (70,7%) e 10 (91%) isolados, respectivamente. . Nós concluímos que um grande número (75%) de produtores de ESBL também produzem AmpC e que o método do disco PBA é um método muito útil e confiável para uso rotineiro em laboratórios.Palavras-chaveAmp C beta lacatamase, ESBL, ácido fenil borónico, teste enzimático tridimensional.
Como citar este artigo:
VANDANA KE, HONNAVAR AMAC LACTAMASES BETA ENTRE ESBL PRODUÇÃO ESCHERICHIA COLI E KLEBSIELLA PNEUMONIAE- SE VOCÊ NÃO OLHAR, você não vai encontrar .. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstico [serial online] 2009 agosto [citada: 2018 29 de agosto ]; 3: 1653-1656. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=August&volume=3&issue=4&page=1653-1656&id=547
IntroduçãoA produção de beta lactamases de espectro estendido (ESBLs) tem sido relatada em praticamente todas as espécies de Enterobacteraceae, o que complica muito a terapia para infecções causadas por esses organismos. No entanto, a frequência dos isolados que produzem beta-lactamases AmpC é amplamente desconhecida devido a dificuldades na detecção fenotípica e confusão sobre a convenção de notificação apropriada (1) , (2) . A beta-lactamase Amp C é muitas vezes identificada erroneamente como ESBL. A detecção de isolados de Amp C é clinicamente importante, não apenas por causa de sua resistência mais ampla às cefalosporinas, mas também porque a resistência a carbapenem pode surgir em tais mutações por mais mutações, resultando na redução da expressão de porina (3) , (4) Aqui, nós estudamos a prevalência de beta-lactamases Amp C em isolados de E. coli e Klebsiella que produzem ESBLs.
Material e métodos
Um total de 52 isolados clínicos de E. coli e Klebsiella produtoras de ESBL de um hospital terciário foram analisados para a produção de beta-lactamase Amp C. A produção de ESBL foi testada pelo método de aproximação de disco usando Co-amoxiclav e cefotaxima (5) . A produção de Amp C foi detectada pelo método de aumento do disco de ácido borônico (6) e comparada com o teste tridimensional de enzima (3DET) como padrão-ouro (7). No primeiro método, colocaram-se 2 discos de cefoxitina (30 µg) num relvado de placa Mueller Hinton Agar inoculado com uma suspensão ajustada com turbidez 0,5 McFarland da estirpe de teste. A um dos discos, adicionaram-se 400 µg de ácido fenil borónico (Sigma-Aldrich). Após incubação durante a noite a 37 ° C, as zonas de inibição foram medidas. O aumento da zona de inibição por 5 mm em torno de um disco de cefoxitina com PBA, em comparação com um disco com cefoxitina sozinho, foi tomado como um resultado positivo para a produção de Amp C.Para o 3DET, os extractos de enzima brutos foram preparados por pastilhas celulares centrifugadas por congelação e descongelação de culturas de caldo de isolados bacterianos. Os extractos enzimáticos foram então inoculados em poços num relvado de placa MHA inoculado com E. coli, ATCC 25922 e um disco de cefoxitina foi colocado sobre ele. Fendas lineares foram feitas a partir do poço direcionando para o disco, a 3mm de distância. As placas foram lidas ap incubao durante a noite a 37. Qualquer crescimento aumentado da estirpe indicadora diminuindo o raio da zona de inibio da cefoxitina no ponto final da fenda, foi considerado como positivo para Amp C (Tabela / Fig 1).
A suscetibilidade antimicrobiana de isolados teste contra combinações de aminoglicosídeos, cefalosporinas, monobactos, beta-lactâmicos e inibidores de beta lactamase, fluoroquinolonas e carbapenêmicos, foi testada pelo método de difusão em disco de Kirbey Bauer, de acordo com os padrões CLSI (8) .
Resultados
Do total de 52 isolados, E.coli (n = 41) e K.pneumoniae (n = 11) foram obtidos a partir da urina (50) e pus (2). Dos 41 E.coli isoaltes, 24 (58,5%) produziram Amp C pelo método do disco PBA, enquanto o método 3DET detectou mais 5 isolados Amp C positivos (n = 29, 70,7%). Dos 11 isolados de K.pneumoniae, 10 (91%) foram considerados positivos pelo método 3DET que detectou um isolado extra em comparação com o método PBA (82%) (Tabela / Fig. 2). Todos os 52 isolados eram resistentes a cefoxitina. A sensibilidade e especificidade do método PBA foram encontradas em 85% e 100%, respectivamente, quando comparado ao método 3DET. Os resultados da AST destas cepas são apresentados em (Tabela / Fig. 3). Meropenem foi a única droga que foi encontrada para ser eficaz contra todos esses isolados, seguido por cefoperazona sulbactum, piperacilina tazobactum e amicacina. Três isolados foram suscetíveis à cefipima, todos positivos para Amp C. Todos eram uniformemente resistentes às fluoroquinolonas. A prevalência global de Amp C em isolados produtores de ESBL foi de 75%.Discussão
Organismos superexpressando as beta-lactamases da Amp C são uma grande preocupação clínica, pois geralmente são resistentes a todos os fármacos beta-lactâmicos, exceto cefepima, cefpiroma e carbapenêmicos (9) , (10) . Em contraste com as ESBLs, elas hidrolisam as cefamicinas e não são inibidas pelos inibidores de beta lactamases. Superexpressão Costitutive de Amp C ocorre, quer por desregulação através da mutação do gene Amp R no cromossoma ou por incorporação de um gene AmpC transferível sobre um plasmídeo ou em outro elemento transferível comumente chamado como mediadas por plasmídeo amp C beta lactamase (10) , (11). A origem do Amp C em E. coli é cromossómica, embora recentemente, o Amp C plasmidico também tenha sido isolado. K.pneumoniae abriga apenas Amp C mediado por plasmídeo. A detecção de qualquer tipo de beta-lactamase Amp C é um desafio para os microbiologistas clínicos. Não há diretrizes em vigor para uma detecção eficiente pelas diretrizes do CLSI. Variações fenotípicas na expressão bacteriana das enzimas tornam a tarefa de detecção laboratorial mais complicada. As implicações clínicas da resistência mediada por ampères C codificadas pelo plasmídeo devem ser abordadas com maior cautela. Não há diretrizes para a detecção desse mecanismo de resistência e, no entanto, há tanta necessidade de laboratórios clínicos para resolver esse problema quanto existe para a detecção de ESBLs.(2) .Há uma escassez de dados de laboratórios indianos sobre a coexistência de múltiplas beta-lactamases em isolados individuais. Estudos de várias partes da Índia relataram a prevalência de Amp C em isolados clínicos de Enterobacteria variando de 2,2% a 20,7% (12) , (13). No entanto, esses estudos foram projetados para estimar a prevalência de AmpC entre todos os isolados clínicos de Enterobacteria. Nosso estudo destaca a importância de métodos de detecção apropriados para as enzimas Amp C nos isolados que já são designados como positivos para ESBL, já que a coexistência de diferentes classes de beta lactamases em um único isolado bacteriano representa um desafio, tanto no diagnóstico como na terapia. O uso de um disco de cefoxitina é útil na triagem de Amp C. No entanto, observamos que 13 isolados resistentes à cefoxitina não produziram Amp C, o que pode ser atribuído a outros mecanismos de resistência como alterações do canal de porina nesses isolados. Embora os isolados tenham demonstrado suscetibilidade in vitro às combinações de cefoperazona sulbactum e piperacilina tazobactum,
Conclusão
No presente estudo, encontramos um grande número de estirpes de E. coli e K.pneumoniae produtoras de ESBL, que também produziram beta lactamases AmpC (75%). Embora o teste 3DET seja o padrão ouro para detecção de Amp C, é trabalhoso e não pode ser realizado rotineiramente em todos os isolados clínicos. O método do disco PBA é simples e confiável para detecção deste mecanismo de resistência. Laboratórios de microbiologia devem proceder para detectar múltiplas beta-lactamases em isolados individuais que já são designados como produtores de ESBL, para que a terapia apropriada possa ser escolhida para o manejo do paciente, e dados confiáveis possam ser gerados em mecanismos de resistência e epidemiologia de infecção hospitalar.Referências1.. da Silva Dias RC, A. Borges-Neto, D'Almeida Ferraiuoli GI, de Oliveira Oliveira, Riley LW, Moreira BM. Prevalência de AmpC e outras beta-lactamases em enterobactérias em um hospital universitário urbano de grande porte no Brasil. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008; 60: 79-87.2.. Hanson ND AmpC beta-lactamases: o que precisamos saber para o futuro? J Antimicrob Chemother, 2003; 52: 2–4.3.. Bradford PA, Urban C, Mariano N, Projan SJ, Rahal JJ, Bush K. A resistência do imipenem em Klebsiella pneumoniae está associada à combinação de ACT-1, uma beta-lactamase AmpC mediada por plasmídeo, e à perda de uma proteína da membrana externa . Antimicrob. Agentes Chemother.1997; 41: 563-69.4.. Martínez-Martínez L, Pascual A, Hernández-Allés S, Álvarez-Díaz D, Suárez AI, Tran J, Benedí VJ et al. Papel das beta-lactamases e porinas nas atividades de carbapenêmicos e cefalosporinas contra Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agentes Chemother.1999; 43: 1669-73.5.. Thomson KS, Sanders CC. Detecção de lactamases de espectro estendido em membros da família Enterobacteriaceae: Comparação dos testes duplo-disco e tridimensional. Antimicrob. Agentes Chemother.1992; 36: 1877-826.. Crompton IE, Cuthbert BK, Lowe G, Waley SG. Inibidores da beta-lactamase. A inibição de serina beta-lactamases por ácidos borônicos específicos. Biochem. 1988; 251: 453-59.7.. Coudron PE, Moland ES, Thomson KS. Ocorrência e detecção de beta-lactamases AmpC entre isolados de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis em um centro médico veterano. J Clin Microbiol 2000; 38: 1791-6.8.. Instituto de Padrões de Laboratório Clínico. Padrões de desempenho para testes de suscetibilidade a discos antimicrobianos. 2006 Wayne PA; M100-S159.. A heterogeneidade de Cephalosporinases AmpC de isolados clínicos de Hafnia alvei expressando fenótipos de resistência à ceftazidima indutíveis ou constitutivos Antimicrob. Agentes Chemother.2000; 44: 3220-3223.10.. Thomson KS, Smith Moland E.Versão 2000: As novas betalactamases de bactérias Gram-negativas no alvorecer do novo milênio. Microbes Infect. 2000; 2: 1225-35.11.. Petit A, Ben-Yaghlane-Bouslama H, L Sofer, Labia R. Caracterização de penicilinases codificadas cromossomicamente em isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae. J. Antimicrob. Chemother. 1992; 29: 629-38.12.. Manchanda V, Singh NP. Ocorrência e detecção de beta-lactamases AmpC entre isolados clínicos Gram-negativos usando um teste tridimensional modificado no Hospital Guru Tegh Bahadur, Delhi, Índia. J Antimicrob Chemother 2003; 51: 415-8.13.. Ratna AK, Menon I, Kapur I, Kulkarni R. Ocorrência e detecção de beta-lactamases AmpC em um hospital de referência em Karnataka. Indian J Med Res 2003; 118: 29-32.
Dr.KEVandana, (MD)
Asso. Prof., Departamento de Microbiologia,
Faculdade de Medicina Kasturba, Manipal,
Udupi, 576104 Karnataka, (Índia).
Ph: 0820-2922322,9902206009
E-mail: vandanake@yahoo.co.in
Abstrato
As beta-lactamases da Amp C conferem resistência a uma ampla variedade de beta lactamas e representam desafios diagnósticos e terapêuticos, já que sua presença não é detectada na presença de ESBLs. Foram avaliados 52 isolados clínicos positivos para ESBL de E. coli (n = 41) e K.pneumoniae (n = 11) para produção de AmpC por um disco de ácido fenilborônico (PBA) e o teste de enzima tridimensional (3DET). O método PBA detectou 24 (58,5%) e 9 (82%) isolados de E. coli e K.pneumoniae como AmpC positivos, enquanto a detecção pelo 3DET aumentou os números para 29 (70,7%) e 10 (91%) isolados, respectivamente. . Nós concluímos que um grande número (75%) de produtores de ESBL também produzem AmpC e que o método do disco PBA é um método muito útil e confiável para uso rotineiro em laboratórios.Palavras-chaveAmp C beta lacatamase, ESBL, ácido fenil borónico, teste enzimático tridimensional.Como citar este artigo:
VANDANA KE, HONNAVAR AMAC LACTAMASES BETA ENTRE ESBL PRODUÇÃO ESCHERICHIA COLI E KLEBSIELLA PNEUMONIAE- SE VOCÊ NÃO OLHAR, você não vai encontrar .. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstico [serial online] 2009 agosto [citada: 2018 29 de agosto ]; 3: 1653-1656. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=August&volume=3&issue=4&page=1653-1656&id=547
IntroduçãoA produção de beta lactamases de espectro estendido (ESBLs) tem sido relatada em praticamente todas as espécies de Enterobacteraceae, o que complica muito a terapia para infecções causadas por esses organismos. No entanto, a frequência dos isolados que produzem beta-lactamases AmpC é amplamente desconhecida devido a dificuldades na detecção fenotípica e confusão sobre a convenção de notificação apropriada (1) , (2) . A beta-lactamase Amp C é muitas vezes identificada erroneamente como ESBL. A detecção de isolados de Amp C é clinicamente importante, não apenas por causa de sua resistência mais ampla às cefalosporinas, mas também porque a resistência a carbapenem pode surgir em tais mutações por mais mutações, resultando na redução da expressão de porina (3) , (4) Aqui, nós estudamos a prevalência de beta-lactamases Amp C em isolados de E. coli e Klebsiella que produzem ESBLs.Material e métodos
Um total de 52 isolados clínicos de E. coli e Klebsiella produtoras de ESBL de um hospital terciário foram analisados para a produção de beta-lactamase Amp C. A produção de ESBL foi testada pelo método de aproximação de disco usando Co-amoxiclav e cefotaxima (5) . A produção de Amp C foi detectada pelo método de aumento do disco de ácido borônico (6) e comparada com o teste tridimensional de enzima (3DET) como padrão-ouro (7). No primeiro método, colocaram-se 2 discos de cefoxitina (30 µg) num relvado de placa Mueller Hinton Agar inoculado com uma suspensão ajustada com turbidez 0,5 McFarland da estirpe de teste. A um dos discos, adicionaram-se 400 µg de ácido fenil borónico (Sigma-Aldrich). Após incubação durante a noite a 37 ° C, as zonas de inibição foram medidas. O aumento da zona de inibição por 5 mm em torno de um disco de cefoxitina com PBA, em comparação com um disco com cefoxitina sozinho, foi tomado como um resultado positivo para a produção de Amp C.Para o 3DET, os extractos de enzima brutos foram preparados por pastilhas celulares centrifugadas por congelação e descongelação de culturas de caldo de isolados bacterianos. Os extractos enzimáticos foram então inoculados em poços num relvado de placa MHA inoculado com E. coli, ATCC 25922 e um disco de cefoxitina foi colocado sobre ele. Fendas lineares foram feitas a partir do poço direcionando para o disco, a 3mm de distância. As placas foram lidas ap incubao durante a noite a 37. Qualquer crescimento aumentado da estirpe indicadora diminuindo o raio da zona de inibio da cefoxitina no ponto final da fenda, foi considerado como positivo para Amp C (Tabela / Fig 1).A suscetibilidade antimicrobiana de isolados teste contra combinações de aminoglicosídeos, cefalosporinas, monobactos, beta-lactâmicos e inibidores de beta lactamase, fluoroquinolonas e carbapenêmicos, foi testada pelo método de difusão em disco de Kirbey Bauer, de acordo com os padrões CLSI (8) .
Resultados
Do total de 52 isolados, E.coli (n = 41) e K.pneumoniae (n = 11) foram obtidos a partir da urina (50) e pus (2). Dos 41 E.coli isoaltes, 24 (58,5%) produziram Amp C pelo método do disco PBA, enquanto o método 3DET detectou mais 5 isolados Amp C positivos (n = 29, 70,7%). Dos 11 isolados de K.pneumoniae, 10 (91%) foram considerados positivos pelo método 3DET que detectou um isolado extra em comparação com o método PBA (82%) (Tabela / Fig. 2). Todos os 52 isolados eram resistentes a cefoxitina. A sensibilidade e especificidade do método PBA foram encontradas em 85% e 100%, respectivamente, quando comparado ao método 3DET. Os resultados da AST destas cepas são apresentados em (Tabela / Fig. 3). Meropenem foi a única droga que foi encontrada para ser eficaz contra todos esses isolados, seguido por cefoperazona sulbactum, piperacilina tazobactum e amicacina. Três isolados foram suscetíveis à cefipima, todos positivos para Amp C. Todos eram uniformemente resistentes às fluoroquinolonas. A prevalência global de Amp C em isolados produtores de ESBL foi de 75%.DiscussãoOrganismos superexpressando as beta-lactamases da Amp C são uma grande preocupação clínica, pois geralmente são resistentes a todos os fármacos beta-lactâmicos, exceto cefepima, cefpiroma e carbapenêmicos (9) , (10) . Em contraste com as ESBLs, elas hidrolisam as cefamicinas e não são inibidas pelos inibidores de beta lactamases. Superexpressão Costitutive de Amp C ocorre, quer por desregulação através da mutação do gene Amp R no cromossoma ou por incorporação de um gene AmpC transferível sobre um plasmídeo ou em outro elemento transferível comumente chamado como mediadas por plasmídeo amp C beta lactamase (10) , (11). A origem do Amp C em E. coli é cromossómica, embora recentemente, o Amp C plasmidico também tenha sido isolado. K.pneumoniae abriga apenas Amp C mediado por plasmídeo. A detecção de qualquer tipo de beta-lactamase Amp C é um desafio para os microbiologistas clínicos. Não há diretrizes em vigor para uma detecção eficiente pelas diretrizes do CLSI. Variações fenotípicas na expressão bacteriana das enzimas tornam a tarefa de detecção laboratorial mais complicada. As implicações clínicas da resistência mediada por ampères C codificadas pelo plasmídeo devem ser abordadas com maior cautela. Não há diretrizes para a detecção desse mecanismo de resistência e, no entanto, há tanta necessidade de laboratórios clínicos para resolver esse problema quanto existe para a detecção de ESBLs.(2) .Há uma escassez de dados de laboratórios indianos sobre a coexistência de múltiplas beta-lactamases em isolados individuais. Estudos de várias partes da Índia relataram a prevalência de Amp C em isolados clínicos de Enterobacteria variando de 2,2% a 20,7% (12) , (13). No entanto, esses estudos foram projetados para estimar a prevalência de AmpC entre todos os isolados clínicos de Enterobacteria. Nosso estudo destaca a importância de métodos de detecção apropriados para as enzimas Amp C nos isolados que já são designados como positivos para ESBL, já que a coexistência de diferentes classes de beta lactamases em um único isolado bacteriano representa um desafio, tanto no diagnóstico como na terapia. O uso de um disco de cefoxitina é útil na triagem de Amp C. No entanto, observamos que 13 isolados resistentes à cefoxitina não produziram Amp C, o que pode ser atribuído a outros mecanismos de resistência como alterações do canal de porina nesses isolados. Embora os isolados tenham demonstrado suscetibilidade in vitro às combinações de cefoperazona sulbactum e piperacilina tazobactum,Conclusão
No presente estudo, encontramos um grande número de estirpes de E. coli e K.pneumoniae produtoras de ESBL, que também produziram beta lactamases AmpC (75%). Embora o teste 3DET seja o padrão ouro para detecção de Amp C, é trabalhoso e não pode ser realizado rotineiramente em todos os isolados clínicos. O método do disco PBA é simples e confiável para detecção deste mecanismo de resistência. Laboratórios de microbiologia devem proceder para detectar múltiplas beta-lactamases em isolados individuais que já são designados como produtores de ESBL, para que a terapia apropriada possa ser escolhida para o manejo do paciente, e dados confiáveis possam ser gerados em mecanismos de resistência e epidemiologia de infecção hospitalar.Referências1.. da Silva Dias RC, A. Borges-Neto, D'Almeida Ferraiuoli GI, de Oliveira Oliveira, Riley LW, Moreira BM. Prevalência de AmpC e outras beta-lactamases em enterobactérias em um hospital universitário urbano de grande porte no Brasil. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008; 60: 79-87.2.. Hanson ND AmpC beta-lactamases: o que precisamos saber para o futuro? J Antimicrob Chemother, 2003; 52: 2–4.3.. Bradford PA, Urban C, Mariano N, Projan SJ, Rahal JJ, Bush K. A resistência do imipenem em Klebsiella pneumoniae está associada à combinação de ACT-1, uma beta-lactamase AmpC mediada por plasmídeo, e à perda de uma proteína da membrana externa . Antimicrob. Agentes Chemother.1997; 41: 563-69.4.. Martínez-Martínez L, Pascual A, Hernández-Allés S, Álvarez-Díaz D, Suárez AI, Tran J, Benedí VJ et al. Papel das beta-lactamases e porinas nas atividades de carbapenêmicos e cefalosporinas contra Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agentes Chemother.1999; 43: 1669-73.5.. Thomson KS, Sanders CC. Detecção de lactamases de espectro estendido em membros da família Enterobacteriaceae: Comparação dos testes duplo-disco e tridimensional. Antimicrob. Agentes Chemother.1992; 36: 1877-826.. Crompton IE, Cuthbert BK, Lowe G, Waley SG. Inibidores da beta-lactamase. A inibição de serina beta-lactamases por ácidos borônicos específicos. Biochem. 1988; 251: 453-59.7.. Coudron PE, Moland ES, Thomson KS. Ocorrência e detecção de beta-lactamases AmpC entre isolados de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis em um centro médico veterano. J Clin Microbiol 2000; 38: 1791-6.8.. Instituto de Padrões de Laboratório Clínico. Padrões de desempenho para testes de suscetibilidade a discos antimicrobianos. 2006 Wayne PA; M100-S159.. A heterogeneidade de Cephalosporinases AmpC de isolados clínicos de Hafnia alvei expressando fenótipos de resistência à ceftazidima indutíveis ou constitutivos Antimicrob. Agentes Chemother.2000; 44: 3220-3223.10.. Thomson KS, Smith Moland E.Versão 2000: As novas betalactamases de bactérias Gram-negativas no alvorecer do novo milênio. Microbes Infect. 2000; 2: 1225-35.11.. Petit A, Ben-Yaghlane-Bouslama H, L Sofer, Labia R. Caracterização de penicilinases codificadas cromossomicamente em isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae. J. Antimicrob. Chemother. 1992; 29: 629-38.12.. Manchanda V, Singh NP. Ocorrência e detecção de beta-lactamases AmpC entre isolados clínicos Gram-negativos usando um teste tridimensional modificado no Hospital Guru Tegh Bahadur, Delhi, Índia. J Antimicrob Chemother 2003; 51: 415-8.13.. Ratna AK, Menon I, Kapur I, Kulkarni R. Ocorrência e detecção de beta-lactamases AmpC em um hospital de referência em Karnataka. Indian J Med Res 2003; 118: 29-32.