Detecção De Staphylococci Produzindo Biofilme: Necessidade Da Hora
MD) Professor de Microbiologia, ** Assistente de pesquisa, Dept de Microbiologia, *** (MD) Professor de Microbiologia, **** (MBBS) Tutor, Dept. de Microbiologia, Faculdade de Medicina Jawaharlal Nehru, Wardha (MS)
Endereço para correspondência :
Dr. S. Bose, Professor de Microbiologia JN Medical College, Sawangi (M), Wardha-442004 (MS) E-mail: drseema11ghosh @ gmail.com, drseema11ghosh @ hotmail.com
Abstrato
Biofilmes são grupos de microrganismos envoltos em um revestimento exopolimérico. Eles têm sido associados a uma variedade de infecções persistentes que respondem mal aos antibióticos convencionais. Neste estudo, a detecção de produções de biofilme por Staphylococcus spp. foi feito usando métodos de ágar vermelho do Congo (CRA), métodos de tubo (TM) e métodos de placa de cultura de tecidos (TCP). Dos 179 Staphylococcus spp., 111 eram S.epidermidis e 68 eram S.aureus. 44,69% de S. epidermidis e 32,96% de S. aureus eram produtores de slime. 97 isolados foram detectados como produtores de limos pelo método TCP, 76 por TN e 11 pelo método CRA. Altas resistências aos antibióticos convencionais foram demonstradas pelos produtores de biofilme.Este estudo sumarizou a prevalência, o padrão de sensibilidade aos antibióticos e o método adequado e reprodutível para a detecção de estafilococos produtores de biofilme.
Palavras-chave
Detecção de biofilme, Staphylococci, ágar vermelho Congo, resistência a antibióticos
Como citar este artigo:
BOSE S, KHODKE M, BASAK S, MALLICK SK. DETECÇÃO DE BIOFILM PRODUZIR STAPHYLOCOCCI: NECESSIDADE DA HORA. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2009 dezembro [citado: 2018 29 de agosto]; 3: 1915-1920. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=December&volume=3&issue=6&page=1915-1920&id=600
IntroduçãoBiofilmes são um grupo de microorganismos ligados a uma superfície e cobertos por uma matriz exopolissacarídica. Várias mudanças ocorrem durante a transição da comunidade planctônica para a anexada à superfície. Em resposta a certos sinais ambientais, novas características fenotípicas se desenvolvem nessas bactérias. A primeira observação registrada sobre o biofilme foi provavelmente dada por Henrici em 1933, que observou que as bactérias da água não são flutuantes livres, mas crescem em superfícies submersas (1) . Certas proteínas de superfície, proteínas extracelulares, polissacarídeos capsulares, adesinas (PS / A) e autolisina (codificadas pelo gene atIE) estão envolvidas na regulação da produção de biofilme. O gene ica codifica a adesão intracelular (ICA) e também pode codificar TS / A e é necessário para a produção de biofilme(1) , (2) , (3) .
Os biofilmes são frequentemente locais para detecção de quórum, influenciando a sua formação. A disponibilidade de nutrientes essenciais, a quimiotaxia em relação à superfície, a mobilidade das bactérias, as adesinas de superfície e a presença de surfactantes são alguns fatores que influenciam a formação do biofilme. (3) , (4) . Usando Bacillus subtilis do solo, o Dr. Stanley Wall mostrou que uma proteína chamada Deg U ajuda as bactérias individuais a decidir se formam um biofilme ou não (5) . Os estafilococos produtores de biofilmes freqüentemente colonizam cateteres e dispositivos médicos e podem causar infecções relacionadas a corpos estranhos. Eles facilmente se ligam a superfícies de polímero. (4) , (5) , (6)Crampton et al mostraram que, como o S epidermidis, o S aureus também possui o locus ica que codifica a função de adesão intracelular e a formação de biofilme (7) . De acordo com um recente anúncio público do National Institute of Health, mais de 60% de todas as infecções são causadas por biofilme (8) . Os organismos de biofilme têm uma resistência inerente aos antibióticos, desinfetantes e germicidas. O uso de material sintético para implantação está amplamente associado à “infecção associada ao implante” devido à produção de biofilme. A longo prazo, podem ser muito prejudiciais devido à doença do complexo imune (2) , (9) , (10) .
Objetivos e Objetivos
Mantendo todas essas coisas em mente, o presente estudo foi realizado para detectar a prevalência de Staphylococcus produtores e não produtores de biofilme isolados de materiais clínicos em nosso laboratório por três métodos diferentes, viz. método da placa de cultura de tecidos (TCP), método do tubo (TM) e ágar vermelho do Congo (CRA) e comparar os três métodos acima mencionados para a produção de biofilme.
Material e métodos
Um total de 179 isolados clínicos de Staphylococci spp. foram isolados do sangue, dispositivos infectados, superfície da pele, urina, pus etc. do departamento de pacientes internos (IPD) de um hospital rural com atendimento terciário na Índia Central durante um período de 1 ano. Os isolados foram identificados pelos testes de coloração de Gram, catalase e coagulase. Estirpes de referência de Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 (produtor de lodo alto),ATCC35983 (produtor de lodo moderado) e ATCC 12228 (produtor de lime) também foram incluídas neste estudo (11) . Detecção de produção de biofilme de 179 Staphylococci spp. foi feito seguindo três métodos.
1. Método da placa de cultura de tecidos (TCP) (8) , (11)
2. Método do tubo (TM) (11) , (12)
3. Método de ágar vermelho do Congo (CRA) (11) , (13)
1. Método da placa de cultura de tecidos
10 ml de caldo de soja tripticase com glicose a 1% foram inoculados com uma ansa de organismo de teste de cultura durante a noite em ágar nutriente. O caldo foi incubado a 370C durante 24 horas. A cultura foi ainda diluída 1: 100 com meio fresco. As placas de cultura de tecidos de fundo plano de 96 pos foram preenchidas com 0,2 mL de culturas diluas individualmente. Apenas caldo estéril foi servido em branco. Similarmente, os organismos de controle também foram diluídos e incubados. Todos os três controles e espaços em branco foram colocados nas placas de cultura de tecidos. As placas de cultura foram incubadas a 370 durante 24 horas. Após a incubação, foi feita uma ligeira batida das placas. Os poços foram lavados com 0,2 ml de solução salina tamponada com fosfato (pH 7,2) quatro vezes para remover as bactérias flutuantes livres. Os biofilmes que permaneceram aderentes às paredes e ao fundo dos poços foram fixados com acetato de sódio a 2% e corados com violeta de cristal a 0,1%. O excesso de mancha foi lavado com água desionizada e as placas foram secas apropriadamente. Densidades ópticas (DO) de biofilme aderente corado foram obtidas com um leitor de micro ELISA com comprimento de onda de 570 nm. A experiência foi realizada em triplicado e repetida três vezes. A média dos valores de OD do meio estéril foi calculada e subtraída de todos os valores do teste(8) , (11) .
2. Método do tubo
10 ml de caldo de soja tripticase com glicose a 1% foi inoculado com uma ansa de organismos de teste de cultura durante a noite em ágar nutriente individualmente. Os caldos foram incubados a 370C durante 24 horas. As culturas foram decantadas e os tubos foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (pH 7,3). Os tubos foram secos e corados com violeta de cristal a 0,1%. O excesso de mancha foi lavado com água desionizada. Os tubos foram secos na posição invertida.
Na formação positiva de biofilme, um filme visível manchado foi visto alinhando a parede e a parte inferior do tubo. Os experimentos foram feitos em triplicata por 3 vezes e lidos como ausentes, fracos, moderados e fortes. (11) , (12)
3. Método Vermelho do Congo
Meio constituído por caldo de infusão de cérebro e coração (37 g / l), sacarose (5 g / l), ágar número 1 (10 g / l) e corante vermelho Congo (0,8 g / l). O corante vermelho do Congo foi preparado como solução aquosa concentrada e autoclavado a 1210 ° C durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado ao agar de infusão de cérebro autoclavado com sacarose a 550 ° C. As placas foram inoculadas com o organismo de teste e incubadas a 370C durante 24 a 48 horas aerobicamente. Colônias negras com consistência cristalina seca indicaram produção de biofilme (11) , (13) .
O teste de sensibilidade antibiótica foi realizado em ágar Muller-Hinton (MHA) usando os seguintes discos antibióticos - penicilina (10 unidades), ampicilina (10µg), ofloxacina (5µg), ciprofloxacina (5µg), cefotaxima (30µg), eritromicina (15µg) trimoxazole (25), amicacina (30), gentamicina (10), netilmicina (30), linezolida (30), vancomicina (30), discos de antibiico foram adquiridos a HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Índia. ATCC Staphylococcus aureus 25922 foi usado como controle. O teste de sensibilidade aos antibióticos foi realizado de acordo com o método de difusão do disco de Kirby-bauer. (14)
Resultados
(Tabela / Fig 1)Um total de 179 estafilococos foram isolados de vários materiais clínicos. Dos 179 Staphylococcus spp. 111 S. epidermidis e 68 S.aureus. Entre 111 S. epidermidis isolados de diferentes amostras clínicas, 44,69% eram produtoras de slime e 17,32% produtoras de slime, enquanto entre 68 S. aureus, 32,96% eram produtoras de slime e 5,03% eram produtoras de slime. Entre S. pidermidis, produtores de biofilme máximo eram de cateter (51 de 111). Entre 51 cateteres dos quais S. epidermidis foram isolados, 40 foram cateteres intravenosos e 11 cateteres de foley. De dois desses cateteres, observou-se crescimento viscoso aderente. Os números máximos de S.aureus produtores de biofilme foram de implantes ortopédicos (19 de 68). Encontramos um padrão de alta resistência entre os produtores de biofilme em comparação com os produtores de não biofilme. Duas cepas de S. aureus foram sensíveis à vancomicina. Ambas as cepas foram produtoras de biofilme(Tabela / Fig 2) .(Tabela / Fig. 3) O valor de OD de biofilme aderente corado foi obtido com um autoreader microELISA com comprimento de onda de 570 nm. O valor de OD menor que 0,120 foi considerado como produtor de não-biofilme, 0,120 -0,240 como produtor de biofilme moderado e mais de 0,240 como produtor forte de biofilme.
(Tabela / Fig. 4) Entre 179 isolados clínicos de Staphylococci, 15,64% foram produtores de biofilme elevado pelos métodos TCP, 12,30% pelo TM e 4,47% pelo método CRA, enquanto 38,55% são produtores moderados de biofilme pelo método TCP, 30,16% pelo TM. e 1,68% pelo método CRA. Na MT, 2 foram encontrados como falsos positivos e 23 como falsos negativos. No método CRA 3 foram falsos positivos e 89 falsos negativos (Tabela / Fig 5) , (Tabela / Fig 6) , (Tabela / Fig 7) .
Discussão
O biofilme bacteriano tem sido considerado há muito tempo como um fator de virulência que contribui para infecções associadas a vários dispositivos médicos e causa infecção nosocomial (12) . (13)O processo exato pelo qual os organismos produtores de biofilme causam doenças é pouco compreendido. No entanto, os mecanismos sugeridos são:
i. Descolamento de células do biofilme do dispositivo médico causando a corrente sanguínea ou infecção do trato urinário.
ii. Formação de endotoxinas
iii. Resistência ao sistema imunológico do hospedeiro
iv. Geração de resistência por troca de plasmídeo (2)
Isolamos 179 Staphylococcal spp. de amostras clínicas, a saber, sangue, pus, urina, fluido de diálise, cateter, swab nasal etc. Todos os isolados foram isolados por procedimento padrão (15)e testado por três testes de rastreio in vitro para a produção de biofilmes, nomeadamente os métodos TCP, TM e CRA. Dos 179 Staphylococcal spp. 111 (62,01%) eram S. epidermidis e 68 (37,99%) eram S. aureus. Descobrimos que, embora a formação de biofilme em dispositivos médicos internos esteja geralmente associada a estafilococos coagulase-negativos, as cepas de S. aureus também são capazes de produzir biofilme (5,03%), o que também foi observado por outros trabalhadores. (16) , (17)
Neste estudo, o padrão de sensibilidade aos antibióticos de vários produtores de biofilme e Staphylococci não produtores spp. Isolados de materiais clínicos foram obtidos. A observação significativa e clinicamente relevante foi que a alta resistência mostrada pelos produtores de biofilme aos antibióticos convencionais do que os produtores não-biofilme. Esta observação foi apoiada por outros estudos também (2) , (10). Todas as cepas foram sensíveis à linezolida e à vancomicina, exceto duas cepas isoladas de cateteres que eram Staphylococcus aureus sensíveis à vancomicina intermediária (VISA). Ambos eram produtores de biofilme. Os glicopéptidos podem não ser agentes antimicrobianos ideais para o tratamento de infecções associadas a corpos estranhos. Isto pode ser devido ao aprisionamento de vancomicina pelos mucopolissacarídeos extracelulares devido ao seu alto peso molecular (10) .
Adotamos o método TCP modificado com período de incubação prolongado por 24 horas em vez de 18 horas. Caldo de soja Trypticase com 1% de meio de glicose foi usado. Este método foi reivindicado superior a outros métodos por vários pesquisadores usando caldo de soja Trypticase sem glicose e caldo de infusão de cérebro com sacarose (11) .
No método TCP, a formação de biofilme foi observada em 97 (54,19%) isolados e os produtores de não biofilme, 82 (45,81%). Este estudo é semelhante à observação feita por Mathur et al (11) . No método de ensaio em tubo, 76 (42,46%) isolados foram encontrados como produtores de biofilme, enquanto 103 (57,54%) foram produtores de não biofilme. No CRA, 11 (6,15%) cepas produziram biofilme e 168 (93,85%) foram produtoras de não biofilme. A taxa de positividade no método CRA em nosso estudo é maior que a de Mathur et al.
Para o cálculo dos dados, os valores de DO obtidos para cepas individuais de estafilococos spp. (11)os valores médios de DO <0,120 foram considerados produtores de não biofilme, 0,120 - 0,240 moderado e> 0,240 considerado forte produtor de biofilme. O método TCP modificado foi considerado como padrão-ouro para este estudo, pois vários pesquisadores provaram este método superior ao método padrão TCP usando caldo de soja Trypticase sem glicose. (8) , (11)
Considerando o TCP modificado como padrão ouro, os dados dos métodos TM e CRA foram comparados. Parâmetros como sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (VPN) e valor preditivo positivo (VPP) foram calculados. Os verdadeiros produtores de biofilme foram positivos pelo TCP, TA e CRA modificados. Falsos positivos foram os produtores de biofilme pelo método TM e CRA, mas não pelo método TCP modificado. Falsos negativos foram produtores de não-biofilme pelos métodos TM e CRA, mas as mesmas cepas foram produtoras de biofilme pelo método TCP modificado. Verdadeiros negativos foram os produtores de não biofilme por todos os métodos. Em nosso estudo, 3 cepas apresentaram resultados falso-positivos e 89 falso-negativos pelo método CRA. Pela TM, apenas 2 cepas eram falso-positivas e 23, falso-negativo, considerando o método TCP modificado como padrão-ouro.
O estudo analítico comparativo dos métodos TM e CRA, com relação ao método TCP modificado, considerado como padrão-ouro neste estudo, foi o seguinte: A sensibilidade do método CRA foi de 8,25%; especificidade 96,34%; PPV 72,72%; e NPV 47,02%. A sensibilidade do método da MT foi de 76,27%; especificidade 97,56%; PPV 97,36%; e VPL 77,66%.
Nosso estudo mostra que o TCP é o melhor teste de triagem para a produção de biofilme do que o CRA e o TM. O teste é fácil de executar e avaliar qualitativa e quantitativamente. Em nosso estudo, a taxa de positividade do método de PCR foi maior do que a observada por outros trabalhadores, por exemplo, Mathur et al. Quem relatou 5,26% de produtores de biofilme pelo método CRA.
Existem alguns métodos altamente precisos como a análise PCR para detectar genes ica como marcador de virulência da infecção estafilocócica. Os não-produtores de biofilme são negativos para icaA e icaD e carecem de todo o operon ica ADBC. [13,17] Mas em um país em desenvolvimento como o nosso, um método de baixo custo para detecção de biofilme é necessário, o que requer equipamento barato e menos conhecimento técnico.
Conclusão
O biofilme pode ser composto por um único ou múltiplos organismos em várias superfícies bióticas e abióticas. Há associação entre produção de biofilme com infecção persistente e falha antibiótica. (19) Assim, na infecção causada por estafilococos produtores de biofilme, a diferenciação em relação ao seu fenótipo de biofilme pode ajudar a modificar a antibioticoterapia e a prevenir infecções relacionadas a dispositivos biomédicos. Um método adequado e reproduzível é necessário para a triagem de produtores de biofilme em qualquer configuração de saúde e este método TCP pode ser recomendado.Referências1.Toole GO, Kaplan HB, formação de Kolter R. Biofilm como desenvolvimento microbiano. Anual revisão de Microbiologia 2000; 54: 49-79.2.Donlan RM, Costerton W. Biofilms: Mecanismos de sobrevivência de microrganismos clinicamente relevantes. Revisão microbiológica clínica 2002; 15 (2): 167-193.3.Carol A, Kumamoto, Marcelo DV. Estilo de vida alternativo Candida albicans: Crescimento em superfícies. Revisão Anual de Microbiologia 2005; 59: 113-133.4.Thomas D e Dia F. Formação de biofilme por bactérias associadas à planta. Revisão Anual da Microbiologia 2007; 61: 401-422.5.Murray EJ, Kiley BT, Stanley-wall RN. Um papel fundamental para o regulador de resposta DegU no controle do comportamento multicelular. Microbiologia 2009; 155: 1-8.6.Schwank S, Z Raquic Z, Zimmerli W, Blaser J. Impacto da formação de biofilme bacteriano em atividades in vitro e in vivo de antibióticos. Agentes antimicrobianos e quimioterapia 1998; 42 (4): 895-898.7.Crampton SE, Gerke C, Sehnell NF, Nicols WW, Gotz F. O locus de adesão intracelular (ica) presente no staphylococcus aureus e é necessário para a formação de biofilme. Infecção e Imunidade 1999; 67 (10): 5427-5433.8.Kim L. Riddle de resistência a biofilme. Agentes antimicrobianos e quimioterapia 2001; 45 (4): 999-1007.9.Raad I, R Darouiche, Hachem R, Sacilowski M, Bodey GP. Antibióticos e prevenção da colonização microbiana de cateteres. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1995; 39 (11): 2397-2400.10.Souli M, Giamarellou H. Efeitos do lodo produzidos por isolados clínicos de estafilococos coagulase-negativos sobre as atividades de vários agentes antimicrobianos. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998; 42 (4): 939-941.11.Mathur T, S Singhal, Khan S, DJ Upadhyay, Fatma T, Rattan A. Detecção de formação de biofilme entre os isolados clínicos de estafilococos: Uma avaliação de três diferentes métodos de triagem. Revista Indiana de Microbiologia Médica 2006; 24 (1): 25-29.12.Christensen GD, Simpson WA, Bisno AL, Beachey EH. Aderência de cepas de Staphylococcus epidermidis produtoras de muco em superfícies lisas. Infecção e Imunidade 1982; 37 (1): 318-326.13.Arciola CR, Baldassarri L., Montanaro L. Presença de genes icaA e icaD e produção de slime em uma coleção de cepas estafilocócicas de infecções associadas a cateteres. Jornal de microbiologia clínica 2001; 39 (6): 2151-2156.14.Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Jurek M. Teste de susceptibilidade antibiótica por um método único padronizado. American Journal of Clinical Patholology 1966; 45: 493-496.15.Miles RS, Amyes SGB. Controle laboratorial da terapia com antibicrobiol, no capítulo: 8 Mackie & McCartney de Microbiologia Médica Prática, 14ª edição: JG Collee, AG Fraser, BP Marmion, A Simmons, Editores. Churchill Livingstone: Reimpressão indiana; 2008. p. 151-178.16.Ammendolia MG, Rosa RD, Montanaro LM, AR Arciola, Baldassarri L. Produção de limo e expressão dos antígenos associados ao lodo por isolados clínicos estafilocócicos. Jornal de microbiologia clínica 1999; 37 (10): 3235-3238.17.O'Gara JP, biofilmes de Humphreys H. Staphylococcus epidermidis: importância e implicações. Journal of Medical microbiology 2001; 50: 582-587.18.Ludwicka A, Switalski LM, Ludlin A, Pulvever G, Wadstrom T. Ensaios bioluminescentes para medição da fixação bacteriana a polietileno. Journal of Microbiological Methods 1988; 26: 175-177.19.Simon AL, Robertson GT. Infecções por biofilme bacteriano e fúngico. Anual revisão de Medicina 2008. 59: 415-428.
Endereço para correspondência :
Dr. S. Bose, Professor de Microbiologia JN Medical College, Sawangi (M), Wardha-442004 (MS) E-mail: drseema11ghosh @ gmail.com, drseema11ghosh @ hotmail.com
Abstrato
Biofilmes são grupos de microrganismos envoltos em um revestimento exopolimérico. Eles têm sido associados a uma variedade de infecções persistentes que respondem mal aos antibióticos convencionais. Neste estudo, a detecção de produções de biofilme por Staphylococcus spp. foi feito usando métodos de ágar vermelho do Congo (CRA), métodos de tubo (TM) e métodos de placa de cultura de tecidos (TCP). Dos 179 Staphylococcus spp., 111 eram S.epidermidis e 68 eram S.aureus. 44,69% de S. epidermidis e 32,96% de S. aureus eram produtores de slime. 97 isolados foram detectados como produtores de limos pelo método TCP, 76 por TN e 11 pelo método CRA. Altas resistências aos antibióticos convencionais foram demonstradas pelos produtores de biofilme.Este estudo sumarizou a prevalência, o padrão de sensibilidade aos antibióticos e o método adequado e reprodutível para a detecção de estafilococos produtores de biofilme.Palavras-chave
Detecção de biofilme, Staphylococci, ágar vermelho Congo, resistência a antibióticos
Como citar este artigo:
BOSE S, KHODKE M, BASAK S, MALLICK SK. DETECÇÃO DE BIOFILM PRODUZIR STAPHYLOCOCCI: NECESSIDADE DA HORA. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2009 dezembro [citado: 2018 29 de agosto]; 3: 1915-1920. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=December&volume=3&issue=6&page=1915-1920&id=600
IntroduçãoBiofilmes são um grupo de microorganismos ligados a uma superfície e cobertos por uma matriz exopolissacarídica. Várias mudanças ocorrem durante a transição da comunidade planctônica para a anexada à superfície. Em resposta a certos sinais ambientais, novas características fenotípicas se desenvolvem nessas bactérias. A primeira observação registrada sobre o biofilme foi provavelmente dada por Henrici em 1933, que observou que as bactérias da água não são flutuantes livres, mas crescem em superfícies submersas (1) . Certas proteínas de superfície, proteínas extracelulares, polissacarídeos capsulares, adesinas (PS / A) e autolisina (codificadas pelo gene atIE) estão envolvidas na regulação da produção de biofilme. O gene ica codifica a adesão intracelular (ICA) e também pode codificar TS / A e é necessário para a produção de biofilme(1) , (2) , (3) .Os biofilmes são frequentemente locais para detecção de quórum, influenciando a sua formação. A disponibilidade de nutrientes essenciais, a quimiotaxia em relação à superfície, a mobilidade das bactérias, as adesinas de superfície e a presença de surfactantes são alguns fatores que influenciam a formação do biofilme. (3) , (4) . Usando Bacillus subtilis do solo, o Dr. Stanley Wall mostrou que uma proteína chamada Deg U ajuda as bactérias individuais a decidir se formam um biofilme ou não (5) . Os estafilococos produtores de biofilmes freqüentemente colonizam cateteres e dispositivos médicos e podem causar infecções relacionadas a corpos estranhos. Eles facilmente se ligam a superfícies de polímero. (4) , (5) , (6)Crampton et al mostraram que, como o S epidermidis, o S aureus também possui o locus ica que codifica a função de adesão intracelular e a formação de biofilme (7) . De acordo com um recente anúncio público do National Institute of Health, mais de 60% de todas as infecções são causadas por biofilme (8) . Os organismos de biofilme têm uma resistência inerente aos antibióticos, desinfetantes e germicidas. O uso de material sintético para implantação está amplamente associado à “infecção associada ao implante” devido à produção de biofilme. A longo prazo, podem ser muito prejudiciais devido à doença do complexo imune (2) , (9) , (10) .
Objetivos e Objetivos
Mantendo todas essas coisas em mente, o presente estudo foi realizado para detectar a prevalência de Staphylococcus produtores e não produtores de biofilme isolados de materiais clínicos em nosso laboratório por três métodos diferentes, viz. método da placa de cultura de tecidos (TCP), método do tubo (TM) e ágar vermelho do Congo (CRA) e comparar os três métodos acima mencionados para a produção de biofilme.
Material e métodos
Um total de 179 isolados clínicos de Staphylococci spp. foram isolados do sangue, dispositivos infectados, superfície da pele, urina, pus etc. do departamento de pacientes internos (IPD) de um hospital rural com atendimento terciário na Índia Central durante um período de 1 ano. Os isolados foram identificados pelos testes de coloração de Gram, catalase e coagulase. Estirpes de referência de Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 (produtor de lodo alto),ATCC35983 (produtor de lodo moderado) e ATCC 12228 (produtor de lime) também foram incluídas neste estudo (11) . Detecção de produção de biofilme de 179 Staphylococci spp. foi feito seguindo três métodos.1. Método da placa de cultura de tecidos (TCP) (8) , (11)
2. Método do tubo (TM) (11) , (12)
3. Método de ágar vermelho do Congo (CRA) (11) , (13)
1. Método da placa de cultura de tecidos
10 ml de caldo de soja tripticase com glicose a 1% foram inoculados com uma ansa de organismo de teste de cultura durante a noite em ágar nutriente. O caldo foi incubado a 370C durante 24 horas. A cultura foi ainda diluída 1: 100 com meio fresco. As placas de cultura de tecidos de fundo plano de 96 pos foram preenchidas com 0,2 mL de culturas diluas individualmente. Apenas caldo estéril foi servido em branco. Similarmente, os organismos de controle também foram diluídos e incubados. Todos os três controles e espaços em branco foram colocados nas placas de cultura de tecidos. As placas de cultura foram incubadas a 370 durante 24 horas. Após a incubação, foi feita uma ligeira batida das placas. Os poços foram lavados com 0,2 ml de solução salina tamponada com fosfato (pH 7,2) quatro vezes para remover as bactérias flutuantes livres. Os biofilmes que permaneceram aderentes às paredes e ao fundo dos poços foram fixados com acetato de sódio a 2% e corados com violeta de cristal a 0,1%. O excesso de mancha foi lavado com água desionizada e as placas foram secas apropriadamente. Densidades ópticas (DO) de biofilme aderente corado foram obtidas com um leitor de micro ELISA com comprimento de onda de 570 nm. A experiência foi realizada em triplicado e repetida três vezes. A média dos valores de OD do meio estéril foi calculada e subtraída de todos os valores do teste(8) , (11) .
2. Método do tubo
10 ml de caldo de soja tripticase com glicose a 1% foi inoculado com uma ansa de organismos de teste de cultura durante a noite em ágar nutriente individualmente. Os caldos foram incubados a 370C durante 24 horas. As culturas foram decantadas e os tubos foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (pH 7,3). Os tubos foram secos e corados com violeta de cristal a 0,1%. O excesso de mancha foi lavado com água desionizada. Os tubos foram secos na posição invertida.
Na formação positiva de biofilme, um filme visível manchado foi visto alinhando a parede e a parte inferior do tubo. Os experimentos foram feitos em triplicata por 3 vezes e lidos como ausentes, fracos, moderados e fortes. (11) , (12)
3. Método Vermelho do Congo
Meio constituído por caldo de infusão de cérebro e coração (37 g / l), sacarose (5 g / l), ágar número 1 (10 g / l) e corante vermelho Congo (0,8 g / l). O corante vermelho do Congo foi preparado como solução aquosa concentrada e autoclavado a 1210 ° C durante 15 minutos. Em seguida, foi adicionado ao agar de infusão de cérebro autoclavado com sacarose a 550 ° C. As placas foram inoculadas com o organismo de teste e incubadas a 370C durante 24 a 48 horas aerobicamente. Colônias negras com consistência cristalina seca indicaram produção de biofilme (11) , (13) .
O teste de sensibilidade antibiótica foi realizado em ágar Muller-Hinton (MHA) usando os seguintes discos antibióticos - penicilina (10 unidades), ampicilina (10µg), ofloxacina (5µg), ciprofloxacina (5µg), cefotaxima (30µg), eritromicina (15µg) trimoxazole (25), amicacina (30), gentamicina (10), netilmicina (30), linezolida (30), vancomicina (30), discos de antibiico foram adquiridos a HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Índia. ATCC Staphylococcus aureus 25922 foi usado como controle. O teste de sensibilidade aos antibióticos foi realizado de acordo com o método de difusão do disco de Kirby-bauer. (14)
Resultados
(Tabela / Fig 1)Um total de 179 estafilococos foram isolados de vários materiais clínicos. Dos 179 Staphylococcus spp. 111 S. epidermidis e 68 S.aureus. Entre 111 S. epidermidis isolados de diferentes amostras clínicas, 44,69% eram produtoras de slime e 17,32% produtoras de slime, enquanto entre 68 S. aureus, 32,96% eram produtoras de slime e 5,03% eram produtoras de slime. Entre S. pidermidis, produtores de biofilme máximo eram de cateter (51 de 111). Entre 51 cateteres dos quais S. epidermidis foram isolados, 40 foram cateteres intravenosos e 11 cateteres de foley. De dois desses cateteres, observou-se crescimento viscoso aderente. Os números máximos de S.aureus produtores de biofilme foram de implantes ortopédicos (19 de 68). Encontramos um padrão de alta resistência entre os produtores de biofilme em comparação com os produtores de não biofilme. Duas cepas de S. aureus foram sensíveis à vancomicina. Ambas as cepas foram produtoras de biofilme(Tabela / Fig 2) .(Tabela / Fig. 3) O valor de OD de biofilme aderente corado foi obtido com um autoreader microELISA com comprimento de onda de 570 nm. O valor de OD menor que 0,120 foi considerado como produtor de não-biofilme, 0,120 -0,240 como produtor de biofilme moderado e mais de 0,240 como produtor forte de biofilme.(Tabela / Fig. 4) Entre 179 isolados clínicos de Staphylococci, 15,64% foram produtores de biofilme elevado pelos métodos TCP, 12,30% pelo TM e 4,47% pelo método CRA, enquanto 38,55% são produtores moderados de biofilme pelo método TCP, 30,16% pelo TM. e 1,68% pelo método CRA. Na MT, 2 foram encontrados como falsos positivos e 23 como falsos negativos. No método CRA 3 foram falsos positivos e 89 falsos negativos (Tabela / Fig 5) , (Tabela / Fig 6) , (Tabela / Fig 7) .
Discussão
O biofilme bacteriano tem sido considerado há muito tempo como um fator de virulência que contribui para infecções associadas a vários dispositivos médicos e causa infecção nosocomial (12) . (13)O processo exato pelo qual os organismos produtores de biofilme causam doenças é pouco compreendido. No entanto, os mecanismos sugeridos são:i. Descolamento de células do biofilme do dispositivo médico causando a corrente sanguínea ou infecção do trato urinário.
ii. Formação de endotoxinas
iii. Resistência ao sistema imunológico do hospedeiro
iv. Geração de resistência por troca de plasmídeo (2)
Isolamos 179 Staphylococcal spp. de amostras clínicas, a saber, sangue, pus, urina, fluido de diálise, cateter, swab nasal etc. Todos os isolados foram isolados por procedimento padrão (15)e testado por três testes de rastreio in vitro para a produção de biofilmes, nomeadamente os métodos TCP, TM e CRA. Dos 179 Staphylococcal spp. 111 (62,01%) eram S. epidermidis e 68 (37,99%) eram S. aureus. Descobrimos que, embora a formação de biofilme em dispositivos médicos internos esteja geralmente associada a estafilococos coagulase-negativos, as cepas de S. aureus também são capazes de produzir biofilme (5,03%), o que também foi observado por outros trabalhadores. (16) , (17)
Neste estudo, o padrão de sensibilidade aos antibióticos de vários produtores de biofilme e Staphylococci não produtores spp. Isolados de materiais clínicos foram obtidos. A observação significativa e clinicamente relevante foi que a alta resistência mostrada pelos produtores de biofilme aos antibióticos convencionais do que os produtores não-biofilme. Esta observação foi apoiada por outros estudos também (2) , (10). Todas as cepas foram sensíveis à linezolida e à vancomicina, exceto duas cepas isoladas de cateteres que eram Staphylococcus aureus sensíveis à vancomicina intermediária (VISA). Ambos eram produtores de biofilme. Os glicopéptidos podem não ser agentes antimicrobianos ideais para o tratamento de infecções associadas a corpos estranhos. Isto pode ser devido ao aprisionamento de vancomicina pelos mucopolissacarídeos extracelulares devido ao seu alto peso molecular (10) .
Adotamos o método TCP modificado com período de incubação prolongado por 24 horas em vez de 18 horas. Caldo de soja Trypticase com 1% de meio de glicose foi usado. Este método foi reivindicado superior a outros métodos por vários pesquisadores usando caldo de soja Trypticase sem glicose e caldo de infusão de cérebro com sacarose (11) .
No método TCP, a formação de biofilme foi observada em 97 (54,19%) isolados e os produtores de não biofilme, 82 (45,81%). Este estudo é semelhante à observação feita por Mathur et al (11) . No método de ensaio em tubo, 76 (42,46%) isolados foram encontrados como produtores de biofilme, enquanto 103 (57,54%) foram produtores de não biofilme. No CRA, 11 (6,15%) cepas produziram biofilme e 168 (93,85%) foram produtoras de não biofilme. A taxa de positividade no método CRA em nosso estudo é maior que a de Mathur et al.
Para o cálculo dos dados, os valores de DO obtidos para cepas individuais de estafilococos spp. (11)os valores médios de DO <0,120 foram considerados produtores de não biofilme, 0,120 - 0,240 moderado e> 0,240 considerado forte produtor de biofilme. O método TCP modificado foi considerado como padrão-ouro para este estudo, pois vários pesquisadores provaram este método superior ao método padrão TCP usando caldo de soja Trypticase sem glicose. (8) , (11)
Considerando o TCP modificado como padrão ouro, os dados dos métodos TM e CRA foram comparados. Parâmetros como sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (VPN) e valor preditivo positivo (VPP) foram calculados. Os verdadeiros produtores de biofilme foram positivos pelo TCP, TA e CRA modificados. Falsos positivos foram os produtores de biofilme pelo método TM e CRA, mas não pelo método TCP modificado. Falsos negativos foram produtores de não-biofilme pelos métodos TM e CRA, mas as mesmas cepas foram produtoras de biofilme pelo método TCP modificado. Verdadeiros negativos foram os produtores de não biofilme por todos os métodos. Em nosso estudo, 3 cepas apresentaram resultados falso-positivos e 89 falso-negativos pelo método CRA. Pela TM, apenas 2 cepas eram falso-positivas e 23, falso-negativo, considerando o método TCP modificado como padrão-ouro.
O estudo analítico comparativo dos métodos TM e CRA, com relação ao método TCP modificado, considerado como padrão-ouro neste estudo, foi o seguinte: A sensibilidade do método CRA foi de 8,25%; especificidade 96,34%; PPV 72,72%; e NPV 47,02%. A sensibilidade do método da MT foi de 76,27%; especificidade 97,56%; PPV 97,36%; e VPL 77,66%.
Nosso estudo mostra que o TCP é o melhor teste de triagem para a produção de biofilme do que o CRA e o TM. O teste é fácil de executar e avaliar qualitativa e quantitativamente. Em nosso estudo, a taxa de positividade do método de PCR foi maior do que a observada por outros trabalhadores, por exemplo, Mathur et al. Quem relatou 5,26% de produtores de biofilme pelo método CRA.
Existem alguns métodos altamente precisos como a análise PCR para detectar genes ica como marcador de virulência da infecção estafilocócica. Os não-produtores de biofilme são negativos para icaA e icaD e carecem de todo o operon ica ADBC. [13,17] Mas em um país em desenvolvimento como o nosso, um método de baixo custo para detecção de biofilme é necessário, o que requer equipamento barato e menos conhecimento técnico.
Conclusão
O biofilme pode ser composto por um único ou múltiplos organismos em várias superfícies bióticas e abióticas. Há associação entre produção de biofilme com infecção persistente e falha antibiótica. (19) Assim, na infecção causada por estafilococos produtores de biofilme, a diferenciação em relação ao seu fenótipo de biofilme pode ajudar a modificar a antibioticoterapia e a prevenir infecções relacionadas a dispositivos biomédicos. Um método adequado e reproduzível é necessário para a triagem de produtores de biofilme em qualquer configuração de saúde e este método TCP pode ser recomendado.Referências1.Toole GO, Kaplan HB, formação de Kolter R. Biofilm como desenvolvimento microbiano. Anual revisão de Microbiologia 2000; 54: 49-79.2.Donlan RM, Costerton W. Biofilms: Mecanismos de sobrevivência de microrganismos clinicamente relevantes. Revisão microbiológica clínica 2002; 15 (2): 167-193.3.Carol A, Kumamoto, Marcelo DV. Estilo de vida alternativo Candida albicans: Crescimento em superfícies. Revisão Anual de Microbiologia 2005; 59: 113-133.4.Thomas D e Dia F. Formação de biofilme por bactérias associadas à planta. Revisão Anual da Microbiologia 2007; 61: 401-422.5.Murray EJ, Kiley BT, Stanley-wall RN. Um papel fundamental para o regulador de resposta DegU no controle do comportamento multicelular. Microbiologia 2009; 155: 1-8.6.Schwank S, Z Raquic Z, Zimmerli W, Blaser J. Impacto da formação de biofilme bacteriano em atividades in vitro e in vivo de antibióticos. Agentes antimicrobianos e quimioterapia 1998; 42 (4): 895-898.7.Crampton SE, Gerke C, Sehnell NF, Nicols WW, Gotz F. O locus de adesão intracelular (ica) presente no staphylococcus aureus e é necessário para a formação de biofilme. Infecção e Imunidade 1999; 67 (10): 5427-5433.8.Kim L. Riddle de resistência a biofilme. Agentes antimicrobianos e quimioterapia 2001; 45 (4): 999-1007.9.Raad I, R Darouiche, Hachem R, Sacilowski M, Bodey GP. Antibióticos e prevenção da colonização microbiana de cateteres. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1995; 39 (11): 2397-2400.10.Souli M, Giamarellou H. Efeitos do lodo produzidos por isolados clínicos de estafilococos coagulase-negativos sobre as atividades de vários agentes antimicrobianos. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998; 42 (4): 939-941.11.Mathur T, S Singhal, Khan S, DJ Upadhyay, Fatma T, Rattan A. Detecção de formação de biofilme entre os isolados clínicos de estafilococos: Uma avaliação de três diferentes métodos de triagem. Revista Indiana de Microbiologia Médica 2006; 24 (1): 25-29.12.Christensen GD, Simpson WA, Bisno AL, Beachey EH. Aderência de cepas de Staphylococcus epidermidis produtoras de muco em superfícies lisas. Infecção e Imunidade 1982; 37 (1): 318-326.13.Arciola CR, Baldassarri L., Montanaro L. Presença de genes icaA e icaD e produção de slime em uma coleção de cepas estafilocócicas de infecções associadas a cateteres. Jornal de microbiologia clínica 2001; 39 (6): 2151-2156.14.Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Jurek M. Teste de susceptibilidade antibiótica por um método único padronizado. American Journal of Clinical Patholology 1966; 45: 493-496.15.Miles RS, Amyes SGB. Controle laboratorial da terapia com antibicrobiol, no capítulo: 8 Mackie & McCartney de Microbiologia Médica Prática, 14ª edição: JG Collee, AG Fraser, BP Marmion, A Simmons, Editores. Churchill Livingstone: Reimpressão indiana; 2008. p. 151-178.16.Ammendolia MG, Rosa RD, Montanaro LM, AR Arciola, Baldassarri L. Produção de limo e expressão dos antígenos associados ao lodo por isolados clínicos estafilocócicos. Jornal de microbiologia clínica 1999; 37 (10): 3235-3238.17.O'Gara JP, biofilmes de Humphreys H. Staphylococcus epidermidis: importância e implicações. Journal of Medical microbiology 2001; 50: 582-587.18.Ludwicka A, Switalski LM, Ludlin A, Pulvever G, Wadstrom T. Ensaios bioluminescentes para medição da fixação bacteriana a polietileno. Journal of Microbiological Methods 1988; 26: 175-177.19.Simon AL, Robertson GT. Infecções por biofilme bacteriano e fúngico. Anual revisão de Medicina 2008. 59: 415-428.