Método Melhorado para Detecção do Estado de Metilação de Genes de Amostras Limitadas, Arquivadas, FF
Abstrato
Propósito: O DNA genômico modificado com bissulfito e os métodos de análise a jusante são as técnicas mais poderosas que são usadas para determinar a metilação do DNA cromossômico e da região promotora. No entanto, a quantidade de material disponível é o fator mais limitante, o que leva continuamente ao desenvolvimento do método mais sensível e específico de determinação da metilação. Na presente comunicação, apresentamos uma modificação melhorada da conversão de bissulfito e MSP.
Método: Nossa estratégia é a conversão de bissulfito de seções de tecido direto no tubo, seguida de purificação de DNA e PCR específico para metilação.
Resultados:Nossos resultados produziram com sucesso uma quantidade elevada de DNA metilado e mostraram amplificação da metilação do promotor usando amostras de biopsia muito escassa, outros tecidos FFPE clínicos e células FNAC. Um grande número de genes poderia ser estudado, o que de outra forma não seria viável usando o método convencional de isolamento de DNA e modificação de bissulfito.
Conclusão: O nosso método melhora substancialmente o protocolo publicado anteriormente em termos de rendimento, qualidade utilizando uma quantidade limitada de tecido a partir de material fixado com formalina e esfregaços de citologia de aspirados por agulha fina.
Abreviaturas: sFRP1: proteínas frisadas secretadas 1, MGMT (O6-metilguanina-DNA metiltransferase), FFPE: Fixado em parafina fixada em formalina, FNA: aspirado com agulha fina, MSP: PCR específico para metilação
Palavras-chave
Metilação, FFPE, FNA
Como citar este artigo:
SAHOO R, BANERJEE A, PAYAL K, WANI, KORLIMARLA A, BABU VC, e outros. MELHORADO MÉTODO PARA DETECÇÃO DE MÉTODO STATUS DE GENES DE LIMITADO, ARQUIVADO, FFPE E FNAC AMOSTRAS .. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstico [serial on-line] 2009 junho [citado: 2018 29 de agosto]; 3: 1493-1499. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=June&volume=3&issue=3&page=1493-1499&id=519
Introdução O
silenciamento genético epigenético pela hipermetilação do promotor de genes supressores de tumor é conhecido por desempenhar um papel significativo na transformação maligna de células tumorais (1) , (2) . Mais recentemente, a atenção dos pesquisadores mudou para o estudo da hipermetilação regional associada ao câncer em ilhas CpG específicas de genes selecionados e sua associação com o silenciamento transcricional. A avaliação da hipermetilação do promotor de genes supressores de tumor tornou-se importante para a compreensão dos mecanismos de transformação maligna.
Diversos métodos foram padronizados no passado recente para a avaliação do status de metilação dos locais específicos, que variam desde técnicas manuais complicadas primitivas até testes automatizados de alto rendimento(3) , (4) , (5) , (6) . A modificação bissulfítica do DNA genômico, seguida do tratamento alcalino, que converte apenas citosina não metilada em uracila, poupando as 5 metil citosinas, é um desses métodos comumente usados. Variantes de sequência em locais particulares podem ser subsequentemente analisadas por amplificação por PCR com iniciadores desenhados para emparelhar com ADN convertido em bissulfito. Embora o método convencional de modificação de bissulfito seja uma técnica bem padronizada para PCR específica para metilação (MSP) (4), a aplicação do mesmo aos tecidos embebidos em parafina fixados em formalina (FFPE) tem certas desvantagens. No passado recente, o valor das amostras de FFPE foi reconhecido e, consequentemente, os ácidos nucléicos derivados desses blocos FFPE estão sendo usados em várias expressões gênicas, estudos de amplificação gênica e para a validação de biomarcadores em muitos estudos retrospectivos (7) , ( 8) , (9) . No entanto, o tecido FFPE ainda é considerado um substrato difícil devido à reticulação extensiva das proteínas e à degradação e fragmentação das macromoléculas causadas pela fixação da formalina (10) , (11). Embora grandes avanços tenham sido feitos no desenvolvimento de técnicas sensíveis para a utilização de material fixado em formol para análises moleculares (7) , (8) , (9) , a avaliação da metilação gênica em tecidos de FFPE ainda é um desafio devido a um pequeno volume. de tecido e fragmentação excessiva de DNA.
Estudos relataram uma perda significativa de DNA molde durante a modificação convencional de bissulfito e isso dificulta seriamente a avaliação do status de metilação de múltiplos genes por MSP (12). A perda de ADN molde também se torna crítica quando está disponível uma quantidade limitada de material de tecido a partir de amostras humanas arquivadas. Poucos métodos tentaram superar essa desvantagem pela modificação in situ do bissulfito do DNA genômico antes da extração, reduzindo assim a perda significativa de DNA molde (13).. Aqui, descrevemos um método para a modificação de bissulfito de uma quantidade limitada de material obtido a partir de FFPE e amostras de agulha fina aspiradas. Usando este método, nós testamos o status de metilação do promotor de genes comumente metilados como O6-metilguanina-DNA metiltransferase (MGMT) em tumores cerebrais e proteínas frisadas secretadas (sFRP1), em amostras de tecido de câncer de cólon e de mama e em amostras de biópsia hepática e compará-lo com o método convencional de modificação de bissulfito.
Material e métodos
Amostras teciduais
Estudamos o status de metilação de múltiplos genes em tecidos fixados em parafina fixados em formalina a partir de 27 amostras. Destes, 23 eram materiais embebidos em parafina fixados em formalina, compreendendo 11 casos de adenocarcinoma do cólon, 5 casos de carcinoma ductal infiltrativo da mama, 5 biópsias hepáticas da cirrose do fígado e 2 gliomas provenientes do tecido cerebral. Os quatro restantes foram esfregaços corados com hematoxilina e eosina de material aspirado por agulha fina que foi diagnosticado como câncer de mama.
Essas amostras foram obtidas no repositório do hospital com autorização do comitê de ética do hospital. A coloração com hematoxilina e eosina foi feita para todas as amostras de FFPE que foram selecionadas para identificar blocos de tecido contendo material de tecido representativo ocupando mais de 80% da área. As secções de tecido mediram aproximadamente 0,5 x 0,5 cm em área, excepto para as biópsias hepáticas que mediram 0,2 x 0,5 cm de tamanho. Uma seção de 10 µm de espessura foi cortada dos blocos selecionados para modificação de bissulfito.
Para esfregaços de aspirados por agulha fina, o vidro de cobertura foi removido após 24-36 horas de tratamento com Xileno, dependendo da idade da lâmina e o material celular foi raspado no tubo para modificação com bissulfito.
Modificação de bissulfito pelo método In-Tube (patente depositada 366 / CHE / 2008)
Uma sec�o de 10 � de espessura foi recolhida num tubo eppendorf de 1,7 mL e foi desparafinizada utilizando duas altera�es de Xileno durante 15 minutos cada e foi desidratada em �cool graduado. As secções foram reidratadas em água destilada durante 5 minutos e foram desnaturadas com NaOH 0,2 M durante 10 minutos. Eles foram lavados em água destilada novamente por 5 minutos e foram incubados em bissulfito de sódio 3M com hidroquinona 0,5 mM por 8 horas a 60 ° C. As secções foram lavadas em água destilada durante 10 minutos e foram tratadas com hidróxido de sódio para remover os aductos. As secções foram novamente lavadas em água destilada durante duas horas a 60 ° C para remover os sais. A água foi descartada por centrifugação das amostras a 1300 rpm durante 30 minutos. O sedimento de células foi lisado pela adição de 100 µl de tampão de lise consistindo em 1 mM de EDTA, 50 mM de Tris, 2.
Material de tecido de punção aspirativa por agulha fina foi reidratado diretamente, sem desparafinização. As etapas do tratamento com bissulfito foram seguidas exatamente como nas seções FFPE, exceto o tratamento com bissulfito de sódio, onde a incubação em bissulfito de sódio 3M com hidroquinona 0,5 mM a 60 ° C foi reduzida para apenas 4 horas.
Purificação do DNA tratado com bissulfito O
DNA foi deixado precipitar durante a noite com 7,7 M de acetato de amónio e 3 vezes mais volume de álcool absoluto. O sedimento resultante foi lavado duas vezes com álcool a 70% e dissolvido em 100 ul de água.
PCR específico para metilação para DNA derivado do método de modificação de bissulfito no tubo.
A PCR foi realizada para um conjunto seleccionado de genes utilizando 2,5 de molde do ADN extrao em cada caso, excepto em amostras de con onde os moldes foram diluos para 10 vezes, como a inibio de PCR foi observada em amostras directas. Conjuntos não-metilados e metilados de primers para poucos genes comumente metilados na maioria dos tipos de tumores foram escolhidos da literatura publicada. Os genes selecionados, seqüências de primers e condições de PCR são dadas em (Tabela / Fig. 1) .
PCR para cada gene foi executado com controles positivos e sem modelo. O controle positivo foi preparado por tratamento de DNA derivado de amostras de buffy coat de indivíduos normais, com Sss I (CpG Methylase), (nº de Cat. No M0226S, NewEngland Biolab®, EUA) por 18 horas e modificando-o pelo tratamento com bissulfito. . Os produtos de PCR foram verificados após electroforese em gel de agarose a 2% e as imagens de gel foram documentadas por um sistema de gel doc.
Modificação de bissulfito pelo método convencional de extração de DNA
O DNA genômico foi extraído usando Chelex 100 (14, 15). Em resumo, uma secção de 10 um de espessura escolhida dos blocos FFPE das amostras foi incubada em 0,5% de Tween-20 durante 10 minutos a 95 ° C. Depois de arrefecer até 55 ° C, adicionaram-se 6 µl de Proteinase K (concentração de 20 µg / µl de Qiagen®) e incubou-se durante a noite. Adicionou-se 400 de Chelex-100 a 5% a cada amostra e incubou-se a 95 durante 10 minutos. O sobrenadante foi recolhido após centrifugação durante 15 minutos. Foram adicionados 200 de clorofmio e a fase superior foi novamente recolhida ap uma centrifugao durante 10 minutos. O ADN foi precipitado utilizando 1/10 do volume de acetato de sódio 3M (pH-7) e 2 volumes de etanol a 100% a -80 oC durante 15 minutos. Após um giro de 15 minutos, o sedimento de DNA foi lavado com etanol a 70% duas vezes. A recuperação do DNA variou entre 500ng-1.
Modificao
de bissulfito Uma vez que o modo convencional de modificao de bissulfito recomendou a utilizao de 1 de ADN como material de partida para modificao, apenas os tecidos que originaram mais de 1 de ADN foram utilizados para o modo convencional de modificao de bissulfito. O protocolo foi adaptado de Frommer M et al (16) e modificado para o tecido FFPE. O sedimento foi dissolvido em 25 de H2O.
PCR Específica Para Metilação De DNA Derivado Pelo Método Convencional De Modificação
A PCR foi realizada em paralelo com o DNA derivado do método do tubo de modificação de bissulfito para todo o conjunto de genes selecionado. Foram tomados 2,5 de ADN modificado com bissulfato como molde para a PCR especica da metilao e a metodologia exacta foi levada a cabo como descrito acima para a PCR especica da metilao.
Resultados
Resultados e discussão
Dado que a metilação do DNA é um evento comum no câncer, avaliamos o status de metilação de alguns dos genes conhecidos como sFRP1 e MGMT em vários tipos de tecido. A PCR especica da metilao foi realizada para o DNA derivado tanto da modificao bissulfito convencional quanto do nosso protocolo modificado dos modos de modificao bissulfito em tubo. Ambos os métodos mostraram uma modificação bem sucedida do bissulfito do DNA, como visto pelos resultados da PCR específica para metilação.
Padrões de Metilação do DNA de um Conjunto Selecionado de Genes em Vários Tipos de Tecidos
Detecção bem sucedida de bandas metiladas e não metiladas por PCR específica para metilação (Tabela / Fig 2)mostraram que nosso método modificado de modificação de bissulfito no tubo funcionou em vários tipos de tecido, como mama, cólon, fígado e cérebro, e material derivado de esfregaços de citologia corados. Entre os genes estudados, a SFRP é um dos genes metilados mais comuns nos cânceres de mama e colorretal. A metilação foi observada em 10/11 amostras de câncer de cólon, 4/5 amostras de biópsias hepáticas e 4/5 amostras de câncer de mama. DNA derivado de tumores cerebrais de glioma mostrou metilação no gene MGMT. Géis representativos para cada tipo de tecido foram mostrados em (Tabela / Fig. 2) Tabela / Fig. 2 A, B, C, D e E.
Comparações da modificação de bissulfito no tubo Vs Os métodos convencionais de modificação de bissulfito por PCR específico de metilação
O método convencional de modificação de bissulfito é limitado pela quantidade de DNA modificado disponível após a modificação. Embora quantidades iguais de materiais teciduais fossem retiradas dos blocos FFPE para o protocolo convencional e modificado do método in-tube de modificação de bissulfito, volumes iguais do modelo usado no MSP não mostraram amplificação no método convencional em comparação com o nosso modelo modificado. método in-tube (Tabela / Fig 3) .
O aumento da quantidade do modelo em MSP, no entanto, mostrou resultados equivalentes pelo método convencional de modificação, provando que houve perda considerável de DNA durante o método convencional de modificação de bissulfito (Tabela / Fig. 4).. Em contraste, o DNA modificado derivado de amostras de câncer de cólon pelo nosso método de modificação em tubo foi diluído antes de seu uso como molde na MSP, para evitar a inibição da PCR por alta concentração de molde (Tabela / Fig 2) Tabela / Fig 2 A. Estes resultados demonstram claramente a vantagem do nosso protocolo modificado do método intra-tubo de modificação de bissulfito no rendimento de quantidades maiores de DNA modificado por bissulfito que poderia ser usado para testar o estado de metilação de múltiplos genes com uma quantidade limitada de material de tecido. Nossos resultados também se correlacionam bem com a perda de DNA previamente estabelecida pelo método convencional de modificação de bissulfito (12) .
O Método Em Tubo De Modificação De Bissulfito Em Materiais De Tecido Derivados De Manchas De Aspiração De Agulha Fina
Os esfregaços de aspiração com agulha fina são o próximo material de tecido conveniente disponível a partir de tecidos humanos após FFPE. Para investigar se a quantidade limitada de células disponíveis a partir desses esfregaços de citologia poderia ser usada para a avaliação do status de metilação de vários genes pós-modificação, padronizamos nossas técnicas em cortes corados de aspirados por agulha fina de cânceres de mama. A modificação do bissulfito pelo nosso método in-tube, seguido pela MSP, mostrou amplificação bem sucedida para o gene sFRP1 [Tabela / Fig2] Tabela / Fig2E. O isolamento convencional de DNA pelo método Chelex produziu de 50 a 250 nanogramas de DNA, o que foi insuficiente para a modificação regular do bissulfito.
A modificação de bissulfito é um método eficaz para a detecção dos padrões de metilação do DNA. O sucesso da metilação do DNA, no entanto, depende da conversão bem-sucedida dos grupos não metilados e do rendimento do DNA modificado. O método convencional de modificação de bissulfito tem considerável perda de DNA durante a purificação (12) . Muitos kits comercialmente disponíveis e técnicas publicadas sugerem o uso de um mínimo de 1 micrograma de DNA para modificação de bissulfito (16). O baixo rendimento de DNA modificado devido à perda de modelo limita o número de genes que podem ser avaliados na amostra dada. Esta é uma desvantagem séria, onde apenas uma pequena quantidade de tecido está disponível a partir de amostras arquivadas. Nosso método modificado supera essa desvantagem, minimizando a perda de DNA e permitindo a análise de metilação de vários genes a partir de pequenas quantidades de materiais arquivados, como tecidos fixados em formalina e esfregaços de aspiração com agulha fina.
O rendimento de DNA modificado com bissulfito modificado é maior do que o rendimento no método convencional, como mostrado pela necessidade da diluição do modelo do DNA modificado em PCR específica para metilação. Como o método usa apenas uma quantidade escassa de tecido, como algumas centenas de células, como nos esfregaços de citologia, permite o uso criterioso de tecido precioso de amostras arquivadas para testar múltiplos genes.
Nosso método tem ampla aplicação, pois os tecidos fixados em formol e os materiais de citologia aspirativa por agulha fina são o material mais amplo disponível para a avaliação de amostras de tecido humano. Eles também representam, de longe, o suprimento mais abundante de amostras de tecido sólido associadas a registros clínicos.
Nosso método de conversão de bissulfito em tubo (patente 366 / CHE / 2008) é uma modificação dos métodos in situ descritos por Umetani et al (13). Ao contrário de seu método, usamos seções inteiras de tecido em vez de áreas microdissecionadas de seções de tecido. Embora seu método possa ter tido a vantagem de estudar os padrões diferenciais de metilação em amostras de tumores heterogêneos, a aderência das seções de tecido nas lâminas foi um problema em nossa experiência, especialmente para um pequeno volume de tecido como em biópsias hepáticas, mesmo em revestimentos slides. Nosso método de usar toda a seção para modificação de bissulfito após a desparafinização resolveu esse problema e evitou a perda de material precioso de tecido. Também introduzimos algumas modificações na técnica original, como a precipitação durante a noite e a purificação do DNA modificado após a extração.
Em conclusão, relatamos aqui, uma modificação técnica e experimental que melhora os métodos descritos anteriormente em vários aspectos, um tratamento mais fácil e seguro de amostras, um encurtamento do tempo necessário para todo o procedimento e um que atende aos padrões de sensibilidade e é muito custo eficaz. Além disso, o método facilita a conversão de bissulfito e a análise de metilação de quantidades muito escassas de tecidos disponíveis a partir de materiais citológicos fixados com formalina e aspirados com agulha fina.
Reconhecimento
Este trabalho de pesquisa foi realizado com total apoio da Health Care Global Enterprises Limited.
Declaração de Interesses Concorrentes
Os autores declaram não haver conflitos ou interesses conflitantes.
Referências
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Método: Nossa estratégia é a conversão de bissulfito de seções de tecido direto no tubo, seguida de purificação de DNA e PCR específico para metilação.
Resultados:Nossos resultados produziram com sucesso uma quantidade elevada de DNA metilado e mostraram amplificação da metilação do promotor usando amostras de biopsia muito escassa, outros tecidos FFPE clínicos e células FNAC. Um grande número de genes poderia ser estudado, o que de outra forma não seria viável usando o método convencional de isolamento de DNA e modificação de bissulfito.
Conclusão: O nosso método melhora substancialmente o protocolo publicado anteriormente em termos de rendimento, qualidade utilizando uma quantidade limitada de tecido a partir de material fixado com formalina e esfregaços de citologia de aspirados por agulha fina.
Abreviaturas: sFRP1: proteínas frisadas secretadas 1, MGMT (O6-metilguanina-DNA metiltransferase), FFPE: Fixado em parafina fixada em formalina, FNA: aspirado com agulha fina, MSP: PCR específico para metilação
Palavras-chave
Metilação, FFPE, FNA
Como citar este artigo:
SAHOO R, BANERJEE A, PAYAL K, WANI, KORLIMARLA A, BABU VC, e outros. MELHORADO MÉTODO PARA DETECÇÃO DE MÉTODO STATUS DE GENES DE LIMITADO, ARQUIVADO, FFPE E FNAC AMOSTRAS .. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstico [serial on-line] 2009 junho [citado: 2018 29 de agosto]; 3: 1493-1499. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2009&month=June&volume=3&issue=3&page=1493-1499&id=519
Introdução O
silenciamento genético epigenético pela hipermetilação do promotor de genes supressores de tumor é conhecido por desempenhar um papel significativo na transformação maligna de células tumorais (1) , (2) . Mais recentemente, a atenção dos pesquisadores mudou para o estudo da hipermetilação regional associada ao câncer em ilhas CpG específicas de genes selecionados e sua associação com o silenciamento transcricional. A avaliação da hipermetilação do promotor de genes supressores de tumor tornou-se importante para a compreensão dos mecanismos de transformação maligna.
Diversos métodos foram padronizados no passado recente para a avaliação do status de metilação dos locais específicos, que variam desde técnicas manuais complicadas primitivas até testes automatizados de alto rendimento(3) , (4) , (5) , (6) . A modificação bissulfítica do DNA genômico, seguida do tratamento alcalino, que converte apenas citosina não metilada em uracila, poupando as 5 metil citosinas, é um desses métodos comumente usados. Variantes de sequência em locais particulares podem ser subsequentemente analisadas por amplificação por PCR com iniciadores desenhados para emparelhar com ADN convertido em bissulfito. Embora o método convencional de modificação de bissulfito seja uma técnica bem padronizada para PCR específica para metilação (MSP) (4), a aplicação do mesmo aos tecidos embebidos em parafina fixados em formalina (FFPE) tem certas desvantagens. No passado recente, o valor das amostras de FFPE foi reconhecido e, consequentemente, os ácidos nucléicos derivados desses blocos FFPE estão sendo usados em várias expressões gênicas, estudos de amplificação gênica e para a validação de biomarcadores em muitos estudos retrospectivos (7) , ( 8) , (9) . No entanto, o tecido FFPE ainda é considerado um substrato difícil devido à reticulação extensiva das proteínas e à degradação e fragmentação das macromoléculas causadas pela fixação da formalina (10) , (11). Embora grandes avanços tenham sido feitos no desenvolvimento de técnicas sensíveis para a utilização de material fixado em formol para análises moleculares (7) , (8) , (9) , a avaliação da metilação gênica em tecidos de FFPE ainda é um desafio devido a um pequeno volume. de tecido e fragmentação excessiva de DNA.
Estudos relataram uma perda significativa de DNA molde durante a modificação convencional de bissulfito e isso dificulta seriamente a avaliação do status de metilação de múltiplos genes por MSP (12). A perda de ADN molde também se torna crítica quando está disponível uma quantidade limitada de material de tecido a partir de amostras humanas arquivadas. Poucos métodos tentaram superar essa desvantagem pela modificação in situ do bissulfito do DNA genômico antes da extração, reduzindo assim a perda significativa de DNA molde (13).. Aqui, descrevemos um método para a modificação de bissulfito de uma quantidade limitada de material obtido a partir de FFPE e amostras de agulha fina aspiradas. Usando este método, nós testamos o status de metilação do promotor de genes comumente metilados como O6-metilguanina-DNA metiltransferase (MGMT) em tumores cerebrais e proteínas frisadas secretadas (sFRP1), em amostras de tecido de câncer de cólon e de mama e em amostras de biópsia hepática e compará-lo com o método convencional de modificação de bissulfito.
Material e métodos
Amostras teciduais
Estudamos o status de metilação de múltiplos genes em tecidos fixados em parafina fixados em formalina a partir de 27 amostras. Destes, 23 eram materiais embebidos em parafina fixados em formalina, compreendendo 11 casos de adenocarcinoma do cólon, 5 casos de carcinoma ductal infiltrativo da mama, 5 biópsias hepáticas da cirrose do fígado e 2 gliomas provenientes do tecido cerebral. Os quatro restantes foram esfregaços corados com hematoxilina e eosina de material aspirado por agulha fina que foi diagnosticado como câncer de mama.
Essas amostras foram obtidas no repositório do hospital com autorização do comitê de ética do hospital. A coloração com hematoxilina e eosina foi feita para todas as amostras de FFPE que foram selecionadas para identificar blocos de tecido contendo material de tecido representativo ocupando mais de 80% da área. As secções de tecido mediram aproximadamente 0,5 x 0,5 cm em área, excepto para as biópsias hepáticas que mediram 0,2 x 0,5 cm de tamanho. Uma seção de 10 µm de espessura foi cortada dos blocos selecionados para modificação de bissulfito.
Para esfregaços de aspirados por agulha fina, o vidro de cobertura foi removido após 24-36 horas de tratamento com Xileno, dependendo da idade da lâmina e o material celular foi raspado no tubo para modificação com bissulfito.
Modificação de bissulfito pelo método In-Tube (patente depositada 366 / CHE / 2008)
Uma sec�o de 10 � de espessura foi recolhida num tubo eppendorf de 1,7 mL e foi desparafinizada utilizando duas altera�es de Xileno durante 15 minutos cada e foi desidratada em �cool graduado. As secções foram reidratadas em água destilada durante 5 minutos e foram desnaturadas com NaOH 0,2 M durante 10 minutos. Eles foram lavados em água destilada novamente por 5 minutos e foram incubados em bissulfito de sódio 3M com hidroquinona 0,5 mM por 8 horas a 60 ° C. As secções foram lavadas em água destilada durante 10 minutos e foram tratadas com hidróxido de sódio para remover os aductos. As secções foram novamente lavadas em água destilada durante duas horas a 60 ° C para remover os sais. A água foi descartada por centrifugação das amostras a 1300 rpm durante 30 minutos. O sedimento de células foi lisado pela adição de 100 µl de tampão de lise consistindo em 1 mM de EDTA, 50 mM de Tris, 2.
Material de tecido de punção aspirativa por agulha fina foi reidratado diretamente, sem desparafinização. As etapas do tratamento com bissulfito foram seguidas exatamente como nas seções FFPE, exceto o tratamento com bissulfito de sódio, onde a incubação em bissulfito de sódio 3M com hidroquinona 0,5 mM a 60 ° C foi reduzida para apenas 4 horas.
Purificação do DNA tratado com bissulfito O
DNA foi deixado precipitar durante a noite com 7,7 M de acetato de amónio e 3 vezes mais volume de álcool absoluto. O sedimento resultante foi lavado duas vezes com álcool a 70% e dissolvido em 100 ul de água.
PCR específico para metilação para DNA derivado do método de modificação de bissulfito no tubo.
A PCR foi realizada para um conjunto seleccionado de genes utilizando 2,5 de molde do ADN extrao em cada caso, excepto em amostras de con onde os moldes foram diluos para 10 vezes, como a inibio de PCR foi observada em amostras directas. Conjuntos não-metilados e metilados de primers para poucos genes comumente metilados na maioria dos tipos de tumores foram escolhidos da literatura publicada. Os genes selecionados, seqüências de primers e condições de PCR são dadas em (Tabela / Fig. 1) .
PCR para cada gene foi executado com controles positivos e sem modelo. O controle positivo foi preparado por tratamento de DNA derivado de amostras de buffy coat de indivíduos normais, com Sss I (CpG Methylase), (nº de Cat. No M0226S, NewEngland Biolab®, EUA) por 18 horas e modificando-o pelo tratamento com bissulfito. . Os produtos de PCR foram verificados após electroforese em gel de agarose a 2% e as imagens de gel foram documentadas por um sistema de gel doc.
Modificação de bissulfito pelo método convencional de extração de DNA
O DNA genômico foi extraído usando Chelex 100 (14, 15). Em resumo, uma secção de 10 um de espessura escolhida dos blocos FFPE das amostras foi incubada em 0,5% de Tween-20 durante 10 minutos a 95 ° C. Depois de arrefecer até 55 ° C, adicionaram-se 6 µl de Proteinase K (concentração de 20 µg / µl de Qiagen®) e incubou-se durante a noite. Adicionou-se 400 de Chelex-100 a 5% a cada amostra e incubou-se a 95 durante 10 minutos. O sobrenadante foi recolhido após centrifugação durante 15 minutos. Foram adicionados 200 de clorofmio e a fase superior foi novamente recolhida ap uma centrifugao durante 10 minutos. O ADN foi precipitado utilizando 1/10 do volume de acetato de sódio 3M (pH-7) e 2 volumes de etanol a 100% a -80 oC durante 15 minutos. Após um giro de 15 minutos, o sedimento de DNA foi lavado com etanol a 70% duas vezes. A recuperação do DNA variou entre 500ng-1.
Modificao
de bissulfito Uma vez que o modo convencional de modificao de bissulfito recomendou a utilizao de 1 de ADN como material de partida para modificao, apenas os tecidos que originaram mais de 1 de ADN foram utilizados para o modo convencional de modificao de bissulfito. O protocolo foi adaptado de Frommer M et al (16) e modificado para o tecido FFPE. O sedimento foi dissolvido em 25 de H2O.
PCR Específica Para Metilação De DNA Derivado Pelo Método Convencional De Modificação
A PCR foi realizada em paralelo com o DNA derivado do método do tubo de modificação de bissulfito para todo o conjunto de genes selecionado. Foram tomados 2,5 de ADN modificado com bissulfato como molde para a PCR especica da metilao e a metodologia exacta foi levada a cabo como descrito acima para a PCR especica da metilao.
Resultados
Resultados e discussão
Dado que a metilação do DNA é um evento comum no câncer, avaliamos o status de metilação de alguns dos genes conhecidos como sFRP1 e MGMT em vários tipos de tecido. A PCR especica da metilao foi realizada para o DNA derivado tanto da modificao bissulfito convencional quanto do nosso protocolo modificado dos modos de modificao bissulfito em tubo. Ambos os métodos mostraram uma modificação bem sucedida do bissulfito do DNA, como visto pelos resultados da PCR específica para metilação.
Padrões de Metilação do DNA de um Conjunto Selecionado de Genes em Vários Tipos de Tecidos
Detecção bem sucedida de bandas metiladas e não metiladas por PCR específica para metilação (Tabela / Fig 2)mostraram que nosso método modificado de modificação de bissulfito no tubo funcionou em vários tipos de tecido, como mama, cólon, fígado e cérebro, e material derivado de esfregaços de citologia corados. Entre os genes estudados, a SFRP é um dos genes metilados mais comuns nos cânceres de mama e colorretal. A metilação foi observada em 10/11 amostras de câncer de cólon, 4/5 amostras de biópsias hepáticas e 4/5 amostras de câncer de mama. DNA derivado de tumores cerebrais de glioma mostrou metilação no gene MGMT. Géis representativos para cada tipo de tecido foram mostrados em (Tabela / Fig. 2) Tabela / Fig. 2 A, B, C, D e E.
Comparações da modificação de bissulfito no tubo Vs Os métodos convencionais de modificação de bissulfito por PCR específico de metilação
O método convencional de modificação de bissulfito é limitado pela quantidade de DNA modificado disponível após a modificação. Embora quantidades iguais de materiais teciduais fossem retiradas dos blocos FFPE para o protocolo convencional e modificado do método in-tube de modificação de bissulfito, volumes iguais do modelo usado no MSP não mostraram amplificação no método convencional em comparação com o nosso modelo modificado. método in-tube (Tabela / Fig 3) .
O aumento da quantidade do modelo em MSP, no entanto, mostrou resultados equivalentes pelo método convencional de modificação, provando que houve perda considerável de DNA durante o método convencional de modificação de bissulfito (Tabela / Fig. 4).. Em contraste, o DNA modificado derivado de amostras de câncer de cólon pelo nosso método de modificação em tubo foi diluído antes de seu uso como molde na MSP, para evitar a inibição da PCR por alta concentração de molde (Tabela / Fig 2) Tabela / Fig 2 A. Estes resultados demonstram claramente a vantagem do nosso protocolo modificado do método intra-tubo de modificação de bissulfito no rendimento de quantidades maiores de DNA modificado por bissulfito que poderia ser usado para testar o estado de metilação de múltiplos genes com uma quantidade limitada de material de tecido. Nossos resultados também se correlacionam bem com a perda de DNA previamente estabelecida pelo método convencional de modificação de bissulfito (12) .
O Método Em Tubo De Modificação De Bissulfito Em Materiais De Tecido Derivados De Manchas De Aspiração De Agulha Fina
Os esfregaços de aspiração com agulha fina são o próximo material de tecido conveniente disponível a partir de tecidos humanos após FFPE. Para investigar se a quantidade limitada de células disponíveis a partir desses esfregaços de citologia poderia ser usada para a avaliação do status de metilação de vários genes pós-modificação, padronizamos nossas técnicas em cortes corados de aspirados por agulha fina de cânceres de mama. A modificação do bissulfito pelo nosso método in-tube, seguido pela MSP, mostrou amplificação bem sucedida para o gene sFRP1 [Tabela / Fig2] Tabela / Fig2E. O isolamento convencional de DNA pelo método Chelex produziu de 50 a 250 nanogramas de DNA, o que foi insuficiente para a modificação regular do bissulfito.
A modificação de bissulfito é um método eficaz para a detecção dos padrões de metilação do DNA. O sucesso da metilação do DNA, no entanto, depende da conversão bem-sucedida dos grupos não metilados e do rendimento do DNA modificado. O método convencional de modificação de bissulfito tem considerável perda de DNA durante a purificação (12) . Muitos kits comercialmente disponíveis e técnicas publicadas sugerem o uso de um mínimo de 1 micrograma de DNA para modificação de bissulfito (16). O baixo rendimento de DNA modificado devido à perda de modelo limita o número de genes que podem ser avaliados na amostra dada. Esta é uma desvantagem séria, onde apenas uma pequena quantidade de tecido está disponível a partir de amostras arquivadas. Nosso método modificado supera essa desvantagem, minimizando a perda de DNA e permitindo a análise de metilação de vários genes a partir de pequenas quantidades de materiais arquivados, como tecidos fixados em formalina e esfregaços de aspiração com agulha fina.
O rendimento de DNA modificado com bissulfito modificado é maior do que o rendimento no método convencional, como mostrado pela necessidade da diluição do modelo do DNA modificado em PCR específica para metilação. Como o método usa apenas uma quantidade escassa de tecido, como algumas centenas de células, como nos esfregaços de citologia, permite o uso criterioso de tecido precioso de amostras arquivadas para testar múltiplos genes.
Nosso método tem ampla aplicação, pois os tecidos fixados em formol e os materiais de citologia aspirativa por agulha fina são o material mais amplo disponível para a avaliação de amostras de tecido humano. Eles também representam, de longe, o suprimento mais abundante de amostras de tecido sólido associadas a registros clínicos.
Nosso método de conversão de bissulfito em tubo (patente 366 / CHE / 2008) é uma modificação dos métodos in situ descritos por Umetani et al (13). Ao contrário de seu método, usamos seções inteiras de tecido em vez de áreas microdissecionadas de seções de tecido. Embora seu método possa ter tido a vantagem de estudar os padrões diferenciais de metilação em amostras de tumores heterogêneos, a aderência das seções de tecido nas lâminas foi um problema em nossa experiência, especialmente para um pequeno volume de tecido como em biópsias hepáticas, mesmo em revestimentos slides. Nosso método de usar toda a seção para modificação de bissulfito após a desparafinização resolveu esse problema e evitou a perda de material precioso de tecido. Também introduzimos algumas modificações na técnica original, como a precipitação durante a noite e a purificação do DNA modificado após a extração.
Em conclusão, relatamos aqui, uma modificação técnica e experimental que melhora os métodos descritos anteriormente em vários aspectos, um tratamento mais fácil e seguro de amostras, um encurtamento do tempo necessário para todo o procedimento e um que atende aos padrões de sensibilidade e é muito custo eficaz. Além disso, o método facilita a conversão de bissulfito e a análise de metilação de quantidades muito escassas de tecidos disponíveis a partir de materiais citológicos fixados com formalina e aspirados com agulha fina.
Reconhecimento
Este trabalho de pesquisa foi realizado com total apoio da Health Care Global Enterprises Limited.
Declaração de Interesses Concorrentes
Os autores declaram não haver conflitos ou interesses conflitantes.
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